大豆衍生肽DYPAY作为强效二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制剂：鉴定、表征与抗糖尿病潜力

《Journal of Future Foods》：Soybean-derived peptide DYPAY as a potent DPP-IV inhibitor: Identification, characterization and antidiabetic potential

　　

全球糖尿病负担的不断加剧亟需安全且可持续的治疗干预措施。二肽基肽酶IV(DPP-IV)通过使胰高血糖素样肽-1(GLP-1)等肠促胰岛素激素失活，在葡萄糖代谢中发挥关键作用，从而调节胰岛素分泌与葡萄糖稳态。因此，DPP-IV抑制已成为2型糖尿病血糖控制的颇具前景的策略。食物源生物活性肽是颇有前景的天然二肽基肽酶-IV(DPP-IV)抑制剂。本研究旨在确定并阐述植物蛋白源中具有强效DPP-IV抑制作用的肽，用于饮食糖尿病干预。研究人员对大豆、花生和水解蛋白的酶解产物在糖尿病小鼠中进行了系统筛选，其中大豆蛋白水解物表现出最显著的降血糖效应。高分辨质谱联合生物信息学分析鉴定出62条生物活性肽序列，从中通过分子对接模拟与体外DPP-IV抑制试验进一步筛选出DYPAY和DFPALR作为先导候选肽。DYPAY表现出更优的抑制效力，其IC50值为162.2 μM，显示出稳健的胃肠稳定性，并表现为竞争性抑制动力学。随后的糖尿病小鼠体内验证表明，口服DYPAY干预4周显著改善了胰岛素敏感性与口服葡萄糖耐量，降低了糖化血红蛋白水平，并减轻了肝脏脂肪变性与肝功能损伤。这些发现将DYPAY定位为靶向DPP-IV抑制的强效抗糖尿病肽，为开发用于糖尿病膳食管理的肽基功能性食品配料提供了科学依据。

研究背景与意义

全球糖尿病负担持续加剧，中国糖尿病患者人数已超过1.4亿，约占全球四分之一，早发性糖尿病患病率与发病率攀升带来严重心脑血管及肾脏神经系统并发症，给医疗与经济体系造成沉重压力。二肽基肽酶IV（DPP-IV）是分布于肠上皮细胞外侧的跨膜丝氨酸蛋白酶，通过N端剪切快速灭活胰高血糖素样肽-1（GLP-1）与葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP），导致葡萄糖稳态失调，是目前临床验证成熟的2型糖尿病治疗靶点。虽已有西格列汀（sitagliptin）、沙格列汀（saxagliptin）等合成DPP-IV抑制剂用于临床降糖，但长期使用可能引发肾损伤等不良反应。因此，开发食物源性DPP-IV抑制剂以规避药物副作用成为迫切需求。植物源生物活性肽因来源丰富、结构多样、消化特性良好，是天然DPP-IV抑制剂的潜在活性成分。大豆、花生、水稻蛋白因日常膳食消费广泛且氨基酸组成各异，其酶解产物被证实具一定DPP-IV抑制活性，但现有研究多聚焦整体水解物降糖效应，高活性肽的系统鉴定、构效关系及分子机制尚不明晰。该研究由Haiying Guo、Manman Liu、Ziyang Wang、Xiaolin Liang、Hongxia Li、Xingtong Fan、Cangliang Shen、Rong Liu等来自中国农业大学功能乳品重点实验室营养与健康系的研究人员开展，旨在从大豆等植物蛋白水解物中系统鉴定强效抗糖尿病肽，阐明其靶向DPP-IV抑制的机制与体内外功效，为糖尿病膳食管理提供肽基功能性食品配料的科学依据，相关成果发表于《Journal of Future Foods》。

主要关键技术方法

研究人员选用市售大豆、花生、水稻分离蛋白为样本原料，经碱性蛋白酶（Alcalase）与胰蛋白酶（trypsin）等序贯酶解制备蛋白水解物，并通过2 kDa超滤膜截留获得低分子量组分。体内研究采用8周龄雄性C57BL/6J小鼠，以高脂饮食联合链脲佐菌素（STZ）诱导建立2型糖尿病模型，设置正常对照组、糖尿病模型组、二甲双胍（MET）阳性药组及不同水解物或合成肽干预组，进行为期4周的每日灌胃处理。体外研究通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对大豆水解物肽组进行鉴定，联合PeptideRanker、ToxinPred、AllerTOP工具进行生物活性与安全性预测筛选，利用AutoDock Vina进行肽与人类DPP-IV（PDB: 1WCY）的分子对接，采用Fmoc固相合成法获得高纯度目标肽并测定IC₅₀值，通过模拟胃肠消化评估稳定性，借助Lineweaver–Burk双倒数作图解析抑制动力学类型，最终整合血清生化、葡萄糖/胰岛素耐受试验（GTT/ITT）、组织病理染色等多维度数据验证功效。

研究结果

3.1. Soybean protein hydrolysate confers superior anti-diabetic effects

研究人员通过对STZ诱导糖尿病小鼠进行大豆、花生、水稻蛋白水解物干预发现，大豆蛋白水解物（SPH）能有效维持体重与摄食饮水模式，显著降低空腹血糖（FBG）与口服葡萄糖耐量试验（GTT）曲线下面积（AUC），最有效地抑制血清DPP-IV酶活性。SPH还可显著下调总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），缓解高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）下降，降低代偿性高胰岛素血症与稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR），改善胰岛素耐受试验（ITT）反应并修复胰腺胰岛形态萎缩，综合抗糖尿病效应优于其余植物水解物。

3.2. Soybean protein hydrolysate attenuates diabetes-induced liver damage

糖尿病小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）与天门冬氨酸氨基转移酶（AST）显著升高，肝组织炎性浸润、脂肪变性（Oil Red O染色）与糖原异常蓄积（PAS染色）明显。SPH干预可有效降低转氨酶水平，减轻肝细胞炎性浸润与脂质沉积，部分恢复肝小叶结构与糖原代谢，显示其对糖尿病相关肝损伤的防护作用。

3.3. Identification and characterization of hypoglycemic peptides in soybean protein hydrolysate

LC-MS/MS从大豆蛋白水解物中共检出12409条肽，经置信度过滤获平均局部置信度≥95%肽段，PeptideRanker预测得分>0.5的89条肽中再经非毒非致敏筛选保留62条。肽长主要分布在4–9残基（占92%），氨基酸组成中天冬氨酸（Asp）、苯丙氨酸（Phe）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro）比例较高，部分具N端酸性残基、次末端脯氨酸及C端芳香族残基特征，契合DPP-IV底物偏好。

3.4. Screening of DPP-IV inhibitory peptides from soybean protein hydrolysate

分子对接显示EFPPRYE、DGWRF、LFPGCPSTY、DYPAY、DFPALR结合能分别为?9.4、?9.3、?8.6、?8.1、?8.0 kcal/mol，与临床药西格列汀（?8.3 kcal/mol）相当或更强。五肽均稳定嵌入DPP-IV活性裂隙，DYPAY在S1口袋（His740、Tyr547）与S2口袋（Asn710、Arg125）形成最广泛氢键网络。合成肽体外抑制试验证实DYPAY与DFPALR的IC₅₀低于200 μM，选作后续研究对象。

3.5. Gastrointestinal stability and competitive inhibition mechanism of DYPAY

模拟胃肠消化后DYPAY与DFPALR分别保留66%与62%的原抑制活性，DYPAY对消化酶抗性更优。Lineweaver–Burk作图显示两肽在不同浓度下直线交于第二象限，符合竞争性抑制特征，表明其直接与底物竞争DPP-IV活性位点结合，阻止底物-酶结合与催化周转。

3.6. DYPAY exhibits superior hypoglycemic efficacy

糖尿病小鼠经DYPAY（100 mg/kg/日）灌胃4周后体重稳定，FBG显著下降，GTT与ITT的AUC降低，血清DPP-IV活性受抑且GLP-1水平升高，TC、TG、LDL-C下降并缓解HDL-C降低，血清胰岛素与HOMA-IR指数下调，胰岛形态萎缩改善，整体降糖与改善胰岛素敏感性效果优于DFPALR并接近西格列汀。

3.7. DYPAY mitigates diabetes-induced hepatic injury through reduction of lipid and glycogen accumulation

DYPAY显著降低糖尿病小鼠血清ALT与AST，减轻肝组织炎性细胞浸润与结构破坏，减少Oil Red O阳性脂质滴沉积并恢复正常PAS染色糖原含量，表明其通过减少异常脂质与糖原蓄积保护肝细胞功能与结构完整。

讨论与结论总结

研究人员在讨论中指出，大豆蛋白因富含疏水与芳香族氨基酸（亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸）及适宜酶解结构，其水解物抗糖尿病活性优于花生与水稻蛋白。通过LC-MS/MS联用生物信息学、分子对接与实验验证的整合流程，从62条安全肽中确立五肽DYPAY为领衔候选，IC₅₀为162.2 μM。DYPAY的N端天冬氨酸与S2带电口袋静电作用、C端酪氨酸占据S1疏水口袋形成π–π与疏水作用、第三位脯氨酸提供构象刚性及跨越S1/S2的四重氢键网络共同赋予其强效竞争抑制力；其紧凑结构与两亲性利于胃肠稳定与潜在口服生物利用度。相较于南瓜籽肽LPGFF（IC₅₀=449.68 μM）与红藻肽MAGVDHI（IC₅₀=159.37 μM），DYPAY具竞争力，虽弱于西格列汀（IC₅₀=18 nM），但天然来源与多重代谢益处适合长期膳食干预。体内研究表明DYPAY除抑制DPP-IV提升GLP-1以改善胰岛素分泌与糖稳态外，还通过增强GLP-1信号抑制肝脂生成、促进脂肪酸氧化及改善胰岛素抵抗实现调脂，并减轻糖尿病肝脂肪变性与糖原紊乱。按体表面积换算，小鼠100 mg/kg/日约相当于60 kg成人8 mg/kg/日（约480 mg/日），可通过浓缩功能性配方实现；DYPAY分子量约627 Da超过肽转运蛋白PepT1偏好二/三肽范围，可能以部分降解片段吸收或经肠道局部作用发挥效应。讨论指出未来需在db/db小鼠、Zucker糖尿病脂肪鼠等模型验证，开展ADME（吸收、分布、代谢、排泄）研究、探究对β细胞功能与L细胞GLP-1释放机制及与其他食品组分协同作用。

结论部分译为：DYPAY作为一种强效抗糖尿病肽的鉴定与验证，为开发针对糖尿病膳食管理的大豆基功能性食品奠定了坚实基础。尽管高脂饮食诱导的糖尿病小鼠模型具生理相关性，但并未完全复现人类2型糖尿病的异质性。为增强本研究转化相关性，未来研究应遵循更结构化路线：首先通过互补动物模型（包括遗传性糖尿病株如db/db小鼠及具代谢综合征特征的模型如Zucker糖尿病脂肪鼠）验证以更好捕捉人类2型糖尿病异质性；其次在哺乳动物系统中进行详细ADME（吸收、分布、代谢、排泄）分析以阐明DYPAY口服生物利用度并开发提升其胃肠转运稳定性与食品基质递送策略；第三，机制研究应进一步考察DYPAY对胰腺β细胞功能、胰岛素分泌动态及肠内分泌L细胞GLP-1释放的影响以全面表征其肠促胰岛素调节机制；此外，探究与其他食品生物活性组分（包括多酚、膳食纤维与互补肽）的潜在协同作用可进一步增强功效并支持多功能食品配方开发。总之，本研究通过整合肽组学、分子对接与生物学验证，成功鉴定五肽DYPAY为天然强效DPP-IV抑制剂。糖尿病小鼠体内研究证明DYPAY不仅改善血糖控制与胰岛素敏感性，还减轻肝功能损伤。DYPAY源自可持续大豆蛋白，兼具良好安全谱与多效抗糖尿病作用，使其成为靶向糖尿病膳食管理的功能性食品开发的有前景候选肽。所建立的系统鉴定流程为从食品源发现生物活性肽提供了可重复框架，推进了作为常规糖尿病药物疗法安全替代或辅助的精准营养策略。未来研究应聚焦临床验证、生物利用度优化及将上述发现转化为全球糖尿病管理的实用膳食干预措施。