利用毒理学多组学方法评估五氯苯酚对斑马鱼的毒性：代谢组与蛋白质组的整合分析

《Journal of Hazardous Materials Advances》：Toxico-multi-omics approach to evaluate pentachlorophenol toxicity in zebrafish; Integration of metabolome and proteome

　　

韩希珠|李花琼|高洛度|金正汉|宋民浩|李志浩

韩国首尔国立大学农业生物技术系及农业与生命科学研究所，首尔

摘要

五氯苯酚是一种长期存在的持久性有机污染物，持续威胁着水生生态系统。本研究采用综合毒理多组学方法，结合目标代谢组学（GC-MS/MS）和蛋白质组学（LC-Orbitrap-MS/MS），探讨了五氯苯酚在斑马鱼体内的系统毒性机制。斑马鱼被分为三组，分别暴露于无暴露组、低剂量组（1/10 LC₅₀）和高剂量组（LC₅₀），暴露时间为48小时。通过整合分析，共识别出75个代谢组学生物标志物和376个蛋白质组学生物标志物，发现包括戊糖磷酸途径及多种氨基酸代谢在内的多个相互关联的代谢途径出现严重紊乱。值得注意的是，关键蛋白（echs1和hibch）以及代谢物（N-乙酰天冬氨酸）的表达下降，表明缬氨酸/支链氨基酸分解代谢和线粒体能量代谢出现了协同紊乱，这一现象得到了相应蛋白质和代谢物变化的支持。此外，丙二醛水平显著升高，说明细胞结构受到了损伤，同时研究还发现了天然防御机制的强烈补偿性激活，尤其是牛磺酸和葡萄糖醛酸代谢的活跃。总体而言，这项综合多组学研究为揭示五氯苯酚引发的代谢和氧化还原紊乱与水生生物的补偿性防御机制之间的复杂相互作用提供了前所未有的机制性见解。

引言

五氯苯酚是一种有机氯类农药，被广泛用作木材防腐剂和杀虫剂[1]。由于其稳定的芳香环和高氯含量，五氯苯酚具有极强的环境持久性，已被全球列为持久性有机污染物和内分泌干扰物[2]、[3]。国际癌症研究机构还将五氯苯酚列为2B类致癌物[4]。

尽管从21世纪初开始，五氯苯酚的生产和使用已受到严格限制或禁止，但它依然是一种普遍存在的重大污染物。在中国2020-2021年对长江的全国性调查中，72个采样点的144份地表水样本中有88.9%检测出了五氯苯酚，下游水域及处理后的饮用水中的浓度甚至可达数十纳克/升[5]。其他研究也报告了中国自来水及井水中五氯苯酚浓度为0.01–0.12微克/升，波兰饮用水中为0.70–3.27微克/升，河流水样中为0.03–640微克/升[4]、[6]。由于五氯苯酚的log Kow值较高且具有亲脂性，它在水生生物体内具有较高的生物浓缩潜力，不同物种、pH值和组织类型下的生物浓缩因子可从10到数百不等[5]、[7]、[8]。这些存在情况与生物积累数据表明，五氯苯酚仍是一种具有生态意义的遗留污染物，尤其是在受污染或曾遭受过污染的水生系统中。

尽管经过数十年的研究，针对五氯苯酚的毒理学评估主要依赖于传统指标，如急性死亡率、形态缺陷，或是用于检测局部氧化应激的特定生化试验[9]、[10]、[11]。虽然这些传统方法对于评估危害仍然至关重要，但它们主要只能反映最终结果或某些特定的生化反应，难以揭示早期的分子起始事件以及整个系统的代谢途径紊乱。相比之下，现代系统毒理学方法，如毒理代谢组学和毒理蛋白质组学，能够对协调发生的代谢、蛋白质组及应激反应变化进行高维度的分析[12]、[13]、[14]。

近期针对水生生物的组学研究进一步表明，五氯苯酚能够扰乱不同物种的代谢和蛋白质组特征。例如，对中国稀有鲦鱼(Gobiocypris rarus)的蛋白质组分析显示，五氯苯酚会影响与转运、代谢、氧化应激以及性别相关调控相关的肝脏蛋白质，还会影响与内分泌紊乱和生殖细胞功能相关的卵巢蛋白质[15]、[16]。在海洋青鳉(Oryzias melastigma)中，五氯苯酚暴露会损害线粒体功能，降低ATP生成，还会改变与氧化应激、细胞骨架结构、细胞色素bc₁复合物及ATP合酶相关的蛋白质表达[17]。代谢组学研究也发现，五氯苯酚会扰乱鲶鱼(Heteropneustes fossilis)的TCA循环相关代谢、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、组氨酸代谢以及支链氨基酸代谢，还会导致血蛤(Tegillarca granosa)的脂质代谢紊乱、钙平衡失调、活性氧产生、ATP耗尽以及线粒体功能受损[18]、[19]。然而，这些研究通常只关注单一的组学层面，使用单一组学平台往往只能获得关于毒理级联反应的片面信息。因此，整合代谢组学和蛋白质组学对于构建一个全面的、相互关联的图谱，展现外源物质暴露所引发的生化紊乱及防御机制至关重要[20]、[21]。

斑马鱼(Danio rerio)因其体型较小、繁殖能力强、基因组特征明确，以及对水生污染物的敏感性强，而被广泛用作水生毒理学和生态毒理学的模式脊椎动物[22]、[23]、[24]、[25]。这些特性使得斑马鱼非常适合用于研究污染物引发的分子层面紊乱，并将组学层面的反应与具有生态毒理学意义的后果联系起来。本研究采用了高度敏感的毒理多组学方法，来阐明五氯苯酚在斑马鱼体内的系统毒性。鉴于五氯苯酚作为氧化磷酸化解偶联剂以及强效氧化应激诱导剂的特性，我们推测亚致死剂量的五氯苯酚暴露会引发复杂的、此前未被发现的代谢组和蛋白质组重编程，尤其会影响能量代谢和氧化还原代谢途径。通过开展针对性的GC-MS/MS代谢组学分析、全面的LC-Orbitrap-MS/MS蛋白质组学分析，再结合严谨的整合路径分析，我们的研究旨在：（1）筛选并鉴定出五氯苯酚毒性的新分子生物标志物；（2）揭示五氯苯酚引发氧化应激及能量代谢紊乱的相关路径；（3）阐明宿主体内被激活的天然生化防御机制。这项综合多组学研究为揭示持久性有机污染物在水生生态系统中的隐性毒理影响提供了前所未有的机制性见解。

章节节选

化学品与试剂

五氯苯酚购自AccuStandard公司。作为内标使用的核糖醇购自Wako公司。MSTFA + 1% TMCS试剂购自Thermo Fisher Scientific公司。盐酸甲氧胺、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇（MeOH）、二甲基亚砜以及吡啶均购自Sigma-Aldrich公司。所使用的碳酸氢铵、尿素、碘乙酰胺以及DL-二硫苏糖醇（均来自Sigma-Aldrich公司）纯度均不低于99%。测序级修饰胰蛋白酶则购自Promega Corporation公司。Sep-Pak

代谢组分析/鉴定、代谢组生物标志物及代谢途径分析

通过GC-MS/MS技术进行的靶向代谢组分析共检测到了397种代谢物，其中包括102种有机酸、78种碳水化合物、75种氨基酸、41种脂肪酸、18种醇类、11种核苷、11种嘌呤、10种酰胺、10种胺类、9种酚类、7种吡啶类、6种类固醇、4种嘧啶类、4种吲哚类、3种酯类、2种萜烯类、2种生育酚、1种唑类、1种甘油酯、1种无机化合物以及1种磷酸，其中共有180种代谢物被成功鉴定。这些代谢物的PCA得分明显显示出差异

结论

在本研究中，暴露于五氯苯酚的斑马鱼其代谢组和蛋白质组特征出现了显著变化，同时伴有与氧化应激相关的紊乱。通过靶向GC–MS/MS分析，共鉴定出75个代谢组生物标志物，这些标志物主要与氨基酸、碳水化合物及有机酸的代谢相关，而路径分析则显示戊糖磷酸途径、氨基酸代谢及相关代谢网络出现了显著紊乱。蛋白质组分析进一步

环境意义

五氯苯酚是一种持久性有机污染物，其亚致死效应往往会被传统的毒理学评估所低估。本研究通过毒理多组学方法发现，五氯苯酚暴露会引发水生生物的全身性代谢紊乱，并使其细胞防御机制不堪重负。在急性暴露条件下所检测到的分子特征可作为五氯苯酚引发分子毒性的早期生物标志物，也为未来开展长期研究提供基础数据

CRediT作者贡献声明

金正汉：概念构思。 高洛度：资源获取、实验实施。 李志浩：写作——审稿与编辑、写作——初稿撰写、项目监督、资源协调、项目管理、方法设计、资金筹措、概念构思。 宋民浩：写作——审稿与编辑、写作——初稿撰写、项目监督、资源协调、项目管理。 李花琼：写作——初稿撰写、数据可视化、方法设计、实验实施、正式数据分析、数据整理、概念构思。 韩希珠：

利益冲突声明

作者们声明不存在任何利益冲突。

致谢

本研究已获得韩国弘益大学的研究伦理批准，如需相关批准证明，可随时索取（IACUC编号为KU23014）。