《Journal of Infection and Public Health》：Endemic circulation without acquired antimicrobial resistance: genomic and phenotypic insights into human Brucella melitensis isolates in Bosnia and Herzegovina
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背景：人类布鲁氏菌病在波斯尼亚和黑塞哥维那（B&H）仍呈地方性流行，但缺乏解释地方性环境下传播模式、种群结构和敏感性谱的综合研究。研究人员旨在通过结合流行病学、表型和基因组方法，对来自B&H的人源马耳他布鲁氏菌（B. melitensis）分离株进行特征描述。
背景：人类布鲁氏菌病在波斯尼亚和黑塞哥维那（B&H）仍呈地方性流行，但缺乏解释地方性环境下传播模式、种群结构和敏感性谱的综合研究。研究人员旨在通过结合流行病学、表型和基因组方法，对来自B&H的人源马耳他布鲁氏菌（B. melitensis）分离株进行特征描述。方法：研究人员从多中心收集中选取2015年至2021年间经确诊布鲁氏菌病患者中获得的60株B. melitensis血分离株，用于表型抗菌药物敏感性试验（AST）和全基因组测序（WGS）。使用三种不同肉汤培养基进行肉汤微量稀释法（BMD），并依据临床与实验室标准协会（CLSI）和欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）标准进行解释。基因组分析包括使用公开可用的基因组进行系统发育基因组学定位，以及筛查获得性抗菌药物耐药决定因子和毒力相关基因。结果：研究人员发现人类布鲁氏菌病主要影响劳动年龄男性，并与职业和家庭暴露密切相关。表型AST显示一线抗菌药物在体外仍有效，但结果受培养基选择和解释框架的显著影响，在CLSI和EUCAST分类之间存在重大差异，特别是链霉素和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑。WGS揭示了东地中海谱系内高度聚集的基因组同质性。未检测到获得性抗菌药物耐药（AMR）基因，而所有分离株中观察到保守的毒力基因库，包括与膜适应相关的基因如mprF。结论：研究人员认为B&H的人类布鲁氏菌病以基因保守的B. melitensis种群内的持续地方性传播为特征。流行病学、表型AST和基因组数据的整合强调了根据布鲁氏菌缓慢进化动态和当地流行病学背景解释敏感性模式的重要性。研究人员建立的基因组基线支持未来整合人类和动物宿主的一体化卫生（One Health）监测。
### 论文解读：无获得性耐药的地方性流行——波斯尼亚和黑塞哥维那人源羊种布鲁氏菌分离株的基因组与表型研究
#### 研究背景与目的
布鲁氏菌病（Brucellosis）是全球重要的人畜共患细菌病，对畜牧业和公共卫生造成重大负担。羊种布鲁氏菌（*Brucella melitensis*，B. melitensis）是人类致病性最强、最常见的布鲁氏菌种，每年估计新增病例160万至210万例，在地中海盆地、中东、非洲、中亚及拉丁美洲持续流行。波斯尼亚和黑塞哥维那（B&H）自20世纪90年代战争后，布鲁氏菌病成为重要公共卫生问题，持续的地方性传播由社会经济因素、畜牧业实践、监测缺口及根除措施不统一等因素驱动。然而，在该区域，整合流行病学、表型和基因组方法解释传播模式、种群结构和抗菌药物敏感性谱的研究尚属空白。现有抗菌药物选择有限，监测抗菌药物耐药（Antimicrobial Resistance, AMR）至关重要，但布鲁氏菌属的抗菌药物敏感性试验（Antimicrobial Susceptibility Testing, AST）受培养基和判读标准影响较大，且缺乏标准化的检测条件。此外，全基因组测序（Whole-Genome Sequencing, WGS）在布鲁氏菌中的应用相对有限，尤其在巴尔干半岛地区尚无基于WGS的人源B. melitensis分析。因此，本研究旨在通过整合流行病学、表型AST和基因组方法，首次对B&H人源B. melitensis分离株进行系统特征描述，阐明传播模式、种系亲缘关系、AMR潜力及毒力基因谱，为未来一体化卫生（One Health）监测提供基因组基线。该论文发表于《Journal of Infection and Public Health》。
#### 关键技术与方法
本研究涉及的主要关键技术方法包括：（1）表型AST采用肉汤微量稀释法（Broth Microdilution, BMD），在三种不同培养基（布鲁氏菌肉汤BB、阳离子调节Mueller-Hinton肉汤加4%裂解马血CAMHB+4%LHB、以及加5%脱纤维羊血CAMHB+5%DSB）中对13种抗菌药物进行测试，并依据临床与实验室标准协会（CLSI）和欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）标准判读；（2）WGS使用Illumina短读长测序，经质量控制、从头组装、注释后，进行核心基因组多位点序列分型（Core Genome Multilocus Sequence Typing, cgMLST）和系统发育分析，并纳入260个公开的B. melitensis参考基因组进行全球背景比较；（3）AMR和毒力基因筛查使用ABRicate工具，分别基于ResFinder、CARD、NCBI AMRFinderPlus和毒力因子数据库（VFDB）。样本来源于B&H五个临床中心（莫斯塔尔、比哈奇、特拉夫尼克、图兹拉、巴尼亚卢卡）2015-2021年间确诊布鲁氏菌病患者血培养分离的60株B. melitensis biovar 3。
#### 研究结果
**描述性流行病学（Descriptive epidemiology）**
通过分析58例患者（60株分离株）的临床记录，研究人员发现人类布鲁氏菌病主要影响劳动年龄男性（69.0%为男性，72.4%为18-64岁），农民是最大职业群体（43.1%），其次为学生/儿童、家务/退休人员及一般劳动力。最常报告的暴露途径是直接接触小型反刍动物（70.7%），食物传播（食用未巴氏消毒乳制品）占13.8%，气溶胶暴露罕见（1.7%）。职业与暴露途径存在显著关联（χ2检验，p=0.015）：所有农民均报告直接动物接触，而食物传播仅出现在非农民群体。两次复发患者的分离株（首次感染与约一年后复发）均来自同一患者，临床记录显示治疗提前中断。
**抗菌药物敏感性试验（Antimicrobial Susceptibility Testing, AST）**
通过BMD法在三种培养基中测定MIC，并分别按CLSI和EUCAST标准判读，研究人员发现一线药物多西环素（DOX）和四环素（TET）在所有条件下均保持100%敏感；利福平（RIF）仅在特定培养基下出现少数中介（1.7%）；庆大霉素（GEN）稳定敏感；链霉素（STR）在应用EUCAST流行病学临界值（ECOFF）后出现较大比例非敏感分类（特别是BB培养基中78.3%判定为耐药）。甲氧苄啶-磺胺甲噁唑（TMP/SMX）在BB培养基中按CLSI标准85%被归类为耐药，而在CAMHB基培养基中全部敏感，但按EUCAST标准则几乎所有分离株均耐药，归因于胸腺嘧啶拮抗作用和判读框架差异。氟喹诺酮类（环丙沙星CIP、左氧氟沙星LEV）MIC较低，但EUCAST标准导致大多数结果进入技术不确定性区（ATU）。阿奇霉素（AZI）MIC普遍偏高，88.3%-93.3%被判定为耐药。两次复发患者的配对比对显示仅微小MIC波动（一个两倍稀释度内），无一致耐药趋势。总体而言，未观察到获得性AMR。
**测序与系统发育结构（Sequencing and phylogenetic structure）**
通过cgMLST分析58个高质量分离株，研究人员发现高度基因组同质性，分离株形成多个小簇，簇内等位基因差异≤4。未见按分离年份或临床中心的明确聚类，来自不同地点和时间的分离株混杂于相同簇中。复发患者的原发与复发分离株映射到相同节点（0等位基因差异）。与260个公开B. melitensis基因组比较，所有B&H分离株聚集于东地中海谱系（基因型II），与同区域动物源分离株交错分布，但明显区别于全球其他谱系。这一结果支持持续的地方性传播，而非局部暴发或新谱系引入。
**AMR与毒力相关基因检测（Detection of AMR and virulence-associated genes）**
通过ABRicate对ResFinder、CARD和NCBI AMRFinderPlus数据库筛查，研究人员在所有分析分离株中未检测到获得性AMR基因、已知耐药相关点突变或质粒相关元件。但均携带染色体编码的mprF基因（*Brucella_suis_mprF*），其编码膜磷脂修饰蛋白，与内在抗阳离子抗菌肽及宿主先天免疫防御机制相关。针对毒力因子数据库（VFDB）的筛查揭示了保守的毒力基因谱：每个分离株均检出43种毒力相关基因，包括编码IV型分泌系统（T4SS）的virB1–virB12、脂多糖（LPS）和O抗原生物合成基因（如lpxA、lpxB、wbdA等）以及细胞内存活与宿主互作基因（如btpA、btpB、cgs、ricA），未见分离株特异性缺失或变异。
#### 讨论与结论
研究人员在讨论部分强调，这是首次对B&H人源B. melitensis分离株进行WGS综合分析。流行病学发现与既往区域数据一致：布鲁氏菌病主要影响农民家庭，食物传播在非农民群体中仍然重要。AST结果揭示一线药物体外活性保持，但判读受培养基和标准（CLSI vs EUCAST）显著影响，方法学差异可导致假性耐药分类，提示在缺乏临床相关性验证时需谨慎解释。基因组层面，高度同质的东地中海谱系种群与布鲁氏菌固有的缓慢进化特征相符，且人源与动物源分离株的混合聚类支持共同循环。复发案例的基因相同性证实持续感染而非再感染或耐药产生。未发现获得性AMR基因，mprF为固有特征，毒力基因谱高度保守，提示临床结局差异可能不源于基因组成。研究局限性包括样本量中等、依赖回顾性数据、无基于人群的系统样本、动物对比有限以及无法建立表型与临床结局的可靠关联。尽管如此，本研究为B&H地方性布鲁氏菌病的流行病学、表型及基因组特征提供了基线框架。
结论部分翻译如下：B&H的人类布鲁氏菌病仍由持续的人畜共患传播驱动，与职业、家庭及食物暴露相关。系统发育基因组学分析揭示了基因同质的种群结构，人源与动物源分离株高度相关，支持跨储库的持续循环而非新谱系引入。复发案例反映了原始感染菌株的持续存在。表型AST显示一线抗菌药物保持体外活性；观察到的变异（包括CLSI与EUCAST分类差异）主要归因于方法和判读差异，而非耐药性出现。但缺乏临床相关性验证限制了确定结论。未检测到获得性AMR决定因子及保守的基因组背景进一步支持了这一解释。这些结果强调了整合表型和基因组数据准确解读敏感性模式并加强监测的重要性。在该背景下，布鲁氏菌病的持续主要由流行病学和社会经济因素驱动，而非AMR出现。本研究建立的基因组基线为该区域未来一体化卫生（One Health）研究奠定了基础，尤其通过跨人畜储库的比较基因组分析以阐明B&H等地方性环境中的传播路径。这些发现也强调了加强人畜整合监测及针对牲畜实施控制措施的紧迫性，这些措施仍是减少地方性布鲁氏菌病负担的核心。未来研究应采用更高分辨率的方法（如基于单核苷酸多态性SNP的系统发育分析），以进一步解析微进化关系及传播动态。
