《The Journal of Molecular Diagnostics》：Performance Evaluation of a Custom Myeloid Assay on the Genexus Integrated Sequencer from a Wide Spectrum of Clinical Variants.
编辑推荐：
一项定制的Genexus髓系检测试剂（CMA）接受了技术评估，以在单一检测格式中检测源自DNA和RNA的变异。该定制检测最初用含有已知髓系变异的商业DNA和RNA对照进行了验证。研究人员选取了75份含有多种DNA和RNA变异的患者标本进行重复测试。CMA在两个
一项定制的Genexus髓系检测试剂（CMA）接受了技术评估，以在单一检测格式中检测源自DNA和RNA的变异。该定制检测最初用含有已知髓系变异的商业DNA和RNA对照进行了验证。研究人员选取了75份含有多种DNA和RNA变异的患者标本进行重复测试。CMA在两个Genexus测序仪上生成了一致的数据，偶尔有样本随机未能通过质量指标。所有22个对照DNA变异均被检出，其中95%被报告为关键变异。临床变异的灵敏度和阳性预测值分别为95.60%和97.60%，对于等位基因频率≥5%的变异，分别上升至98.63%和99.65%。FLT3重复在较低的预期频率下被一致检出。低水平的假阳性关键变异大多是复发的且可过滤。融合检出灵敏度在对照和临床RNA样本中均为100%，97.09%的重复报告了预期的融合。CMA在Genexus平台上24小时内可靠地检出髓系标本中的关键DNA和RNA变异。变体和融合转录本以高灵敏度和最少的核酸输入被识别，为报告临床相关髓系疾病变异提供了快速且精确的工作流程。
**论文解读文章**
**研究背景**
髓系肿瘤是一类由造血细胞异常克隆性增殖引起的血液癌症，其诊断需整合形态学、免疫表型、临床及遗传学发现。主要参考依据包括世界卫生组织（WHO）第5版《造血与淋巴组织肿瘤分类》、2022年国际共识分类（ICC）及更新后的欧洲白血病网（ELN）指南。二代测序（NGS）技术的广泛应用显著提升了髓系肿瘤的分类、预后评估及分子机制理解。然而，DNA和RNA测序在临床实验室中传统上作为独立工作流程进行，导致检测效率较低、周转时间较长。例如，骨髓增生异常综合征（MDS）及急性髓系白血病（AML）的精准分型依赖于同时检测DNA中的单核苷酸变异（SNV）、插入/缺失（Indel）及RNA中的基因融合。目前，现有商业化平台虽能部分实现联合检测，但针对广泛临床变异谱系的技术性能评价尚不充分。因此，研究人员基于Genexus集成测序仪开发了一种定制髓系检测试剂（Custom Myeloid Assay, CMA），旨在评估其对DNA和RNA变异的同步检测能力，以解决临床实践中对快速、高灵敏度、自动化单管检测的迫切需求。本研究论文发表于《The Journal of Molecular Diagnostics》。
**研究方法概述**
研究人员采用以下关键技术方法：
1. **定制检测设计**：基于商业试剂盒Oncomine Myeloid Assay GX v2（OMAv2）开发CMA，通过添加BCORL1、ETNK1、GATA2和UBA1基因的扩增子，并移除非信息性外显子，将DNA面板从540个扩增子缩减至470个，RNA面板保持不变（覆盖35个融合驱动基因及超过700个融合伙伴）。
2. **自动化测序流程**：使用两台Genexus集成测序仪（Ion Torrent Genexus Software版本6.8.0）进行全自动样本到报告流程，DNA和RNA样本分别以26.6 ng和13.3 ng输入量加载于96孔板，最终检测输入量为20 ng DNA和10 ng RNA。生物信息学分析由板载软件完成，包括Torrent Variant Aligner（TVA）进行序列比对、Torrent Variant Caller（TVC）进行变异检出，并采用Oncomine Ion Reporter软件（版本5.18.4）进行关键变异报告。
3. **样本队列**：研究纳入商业对照（Seraseq髓系突变DNA混合物和髓系融合RNA混合物）以及来自梅奥诊所（Mayo Clinic）75份残留临床标本（57份DNA样本和18份RNA样本），来源为外周血（PB）或骨髓（BM），经梅奥诊所IRB批准。
**研究结果**
**Custom Myeloid Assay control DNA sample runs**
通过14次重复运行对照DNA样本，CMA在所有运行中均检出20个SNV/Indel变异（其中19个被持续报告为关键变异），仅NPM1 c.860_863dup因质量阈值在单次运行中被报告。检出等位基因频率（VAF）与预期一致，且DNA输入量≥6.75 ng时变异检出稳定。两个FLT3内部串联重复（ITD）变异在标准输入量下被一致检出，但较低输入量下33 bp ITD缺失。出现6个低VAF假阳性变异，主要位于核苷酸重复或同聚物区域，其中ASXL1 c.1934dup最为常见。
**Custom Myeloid Assay control RNA sample runs**
在16次重复运行中，所有8个对照融合均被100%检出，且在RNA输入量低至0.94 ng时仍保持稳健检测，未出现假阳性。融合读数计数随输入量降低而减少，但在7.5 ng以上保持稳定。5个表达控制基因（PUM1、PSMB2、FBXW2、EIF2B1、TRIM27）及5个定量基因转录本（BAALC、MECOM、WT1、MYC、SMC1A）在重复运行中结果一致。
**Genexus run characteristics of CMA with residual clinical specimens**
在12个GX5芯片上对两台Genexus测序仪进行并行运行，所有24次运行均通过质量控制指标，芯片间总孔数、加载率、富集率及文库指标高度一致。DNA和RNA读长深度在两台仪器间高度相关（R2分别为0.94和0.90），少数质控失败事件被认为是随机技术原因。
**Clinical DNA Sample CMA Runs**
对57份临床DNA样本（共377个变异）进行分析，CMA检出328个预期变异（95.9%），其中242个（70.8%）被报告为关键变异。14个假阴性变异主要为低VAF（<5%）的Indel或复杂事件。灵敏度为95.6%，阳性预测值（PPV）为97.9%；对于VAF≥5%的变异，灵敏度提升至99.0%，PPV为99.7%。预期VAF与观察值高度相关（R2=0.99）。
**Clinical RNA Sample CMA Runs**
对18份临床RNA样本（包含PML::RARA、CBFB::MYH11、RUNX1::RUNX1T1、BCR::ABL1及NUP214::XKR3融合）进行至少4次重复运行，融合检出灵敏度为100%（103次重复中100次报告关键变异）。两个低水平融合（CBFB::MYH11在AA-04样本中仅1/10次检出；RUNX1::RUNX1T1在AA-19样本中1/4次未检出）与参考方法灵敏度下限一致。
**讨论与结论**
本研究对Genexus测序仪上的定制髓系检测试剂（CMA）进行了全面技术评估。CMA在VAF≥5%时显示>95%灵敏度，假阳性极少，与OMAv2规格一致。DNA输入量>5 ng、RNA输入量>1 ng时性能可靠。Genexus平台的易用性、自动化及24小时周转时间使其成为临床NGS检测的可行工具。研究人员强调，更大规模的测试开发研究（包括同一患者的配对DNA和RNA）对于全面的端到端流程审查及确保临床报告最高准确性至关重要。
**研究结论**（翻译自原文结论部分）：总之，CMA是一种用于检测髓系肿瘤中临床相关变异的稳健检测试剂。它对VAF低至5%的变异展现出>95%的灵敏度且假阳性极少，与OMAv2规格一致。在DNA输入量>5 ng和RNA输入量>1 ng时观察到可靠性能。Genexus平台的易用性、自动化及快速周转使其成为临床NGS检测的可行工具。大于本研究技术性能评估的测试开发研究，包括来自同一患者的配对DNA和RNA，对于全面的端到端流程审查以及确保临床报告最高准确性至关重要。
