苯磺酰胺噁二唑衍生物的杂合体具有双重CA II和COX?2抑制活性，表现出抗青光眼和抗炎作用：合成、计算机模拟见解及体外和体内生物评价

《Journal of Medicinal Chemistry》：Hybrids of Benzenesulfonamide Oxadiazole Derivatives with Dual CA II and COX?2 Inhibitory Activity Demonstrating Antiglaucoma and Anti-inflammatory Action: Synthesis, In Silico Insights, and In Vitro and In Vivo Bioevaluation

　　

在这项研究中，研究人员设计、合成并生物评价了新的磺酰胺衍生物5a–g和10a–e的抗炎活性。进行了体外环氧化酶（COX）抑制实验，在合成的化合物中，5b和5d成为最有前景的先导物，兼具COX-2抑制与显著的选择性（COX-2 IC₅₀ = 0.13和0.05 μM，选择性指数SI = 9.25和12.02），以及人碳酸酐酶II（hCA II）抑制（K_i = 39.1 nM和62.6 nM），并对hCA I具有高选择性指数（SI = 933.8和704.2）。体内评价证实，化合物5b和5d（50 mg/kg）具有有前景的镇痛和抗炎作用，起效迅速、作用持续时间长，且溃疡形成风险降低，表明胃肠道安全性改善。此外，在抗青光眼动物模型中，5b表现出显著且持久的眼内压（IOP）降低作用。研究人员进行了计算机研究（分子对接和分子动力学模拟）和X射线晶体学分析，作为概念验证。

### 论文解读

#### 研究背景、问题与研究目的

炎症是机体对有害刺激的正常防御反应，而非甾体抗炎药（NSAIDs）通过抑制环氧化酶（COX）阻断前列腺素合成，广泛用于疼痛和炎症管理。然而，传统NSAIDs对COX-1的高选择性导致胃肠道刺激、出血和溃疡等副作用。为此，研究人员致力于开发高选择性COX-2抑制剂，例如塞来昔布和伐地昔布，但罗非昔布因心血管风险撤市引发了对其心血管安全性的担忧。另一方面，炎症机制不仅涉及前列腺素通路，还包括组织酸中毒，后者通过激活痛觉感受器和促进炎症反应发挥作用。因此，靶向pH调节酶——碳酸酐酶（CAs）成为一种补充策略，可能在与COX-2抑制联合时增强抗炎疗效。此外，碳酸酐酶抑制剂（CAIs）通过抑制眼睫状体中的hCA I、II和IV等亚型减少房水生成，从而降低眼内压（IOP），用于青光眼治疗。然而，经典磺酰胺类CAIs缺乏亚型选择性，导致全身性副作用。为克服这一障碍，Supuran团队提出了“尾链策略”，通过在苯磺酰胺骨架上引入延伸的尾链，使其与CA活性中心非保守氨基酸残基相互作用，提高选择性。

基于上述背景，本研究旨在设计并合成一系列具有双重COX-2和hCA II抑制活性的新型化合物，以期获得兼具抗炎和抗青光眼作用的单分子药物。研究人员以塞来昔布的4-(吡唑-1-基)苯磺酰胺药效团为母核，通过噁二唑连接子引入不同烷基尾链，设计合成了两个系列目标化合物5a–g和10a–e，期望游离磺酰胺基团既能与hCA的催化Zn²⁺结合，又能通过氢键与COX-2结合口袋中的亲水性残基作用而诱导选择性。

#### 研究内容与结论

本研究设计、合成了两个系列共12个新型磺酰胺衍生物（5a–g和10a–e），并进行了系统生物学评价。体外COX-1/COX-2抑制实验表明，多数化合物具有优于COX-1的COX-2选择性。其中，化合物5b（IC₅₀ = 0.13 μM，SI = 9.25）和5d（IC₅₀ = 0.05 μM，SI = 12.02）表现出最强的COX-2抑制活性和选择性。碳酸酐酶抑制实验显示，两个系列化合物对hCA II和hCA XII均保持纳摩尔级抑制活性，且对hCA I具有极高的选择性（SI > 700）。特别是5b对hCA II的K_i为39.1 nM，且对hCA XII的抑制活性也很强（K_i = 34.2 nM）。基于体外双靶标平衡活性，研究人员选择5b和5d进行体内药理学评价。

体内实验结果显示，化合物5b和5d（50 mg/kg）在大鼠热板镇痛模型中迅速起效，并维持镇痛作用至90 min；在角叉菜胶诱导的大鼠足趾肿胀模型中，两化合物在2 h即显著抑制水肿，持续至6 h，效果与布洛芬（25 mg/kg）相当或更优。重要的是，在急性溃疡原性实验中，5b和5d展现出显著降低的胃黏膜损伤，其中5d在1 h时完全保护了胃黏膜（100%抑制），而布洛芬则引起严重的溃疡。在兔青光眼模型中，局部滴眼给予1% 5b溶液后，眼内压（IOP）在60 min时显著降低并持续至实验结束，而5d的作用较弱。计算机模拟（分子对接和200 ns分子动力学模拟）与X射线晶体学分析进一步揭示了化合物与hCA II和COX-2的结合模式：磺酰胺基团与Zn²⁺配位并形成氢键网络，噁二唑和吡唑环与关键残基相互作用，尾链则伸入疏水口袋，模拟结果稳定且与实验数据一致。

该论文发表在《Journal of Medicinal Chemistry》上，研究意义在于：首次报道了兼具高选择性COX-2抑制和hCA II抑制活性的双靶点苯磺酰胺噁二唑衍生物，在体内展现出抗炎、镇痛、抗青光眼作用且胃肠道安全性优于布洛芬，为开发多功能抗炎/抗青光眼先导化合物提供了新策略。

#### 关键方法

本研究采用的关键技术方法包括：1）体外环氧化酶（COX）抑制实验，以塞来昔布为参照测定IC₅₀和选择性指数；2）碳酸酐酶（CA）抑制实验，使用停流CO₂水合法测定hCA I、II和XII的K_i值（酶样品：hCA I和II购自Sigma-Aldrich，重组hCA IX为实验室自制）；3）体内药理学评价：大鼠热板法测镇痛、角叉菜胶致足肿胀法测抗炎、急性溃疡原性实验（SD大鼠，不同时间点观察溃疡指数）、兔青光眼模型（高渗盐水诱导IOP升高后局部给药测IOP，动物伦理批准来自开罗大学药学院）；4）X射线晶体学：使用悬滴蒸气扩散法获得hCA II-10d复合物晶体，同步辐射收集数据，结构解析并精修（PDB ID: 9T4S）；5）分子对接（Schr?dinger Glide SP模式）和200 ns分子动力学模拟（Desmond，OPLS4力场，TIP3P水模型）。

#### 研究结果

**2.2.1. COX-1和COX-2抑制实验**（体外实验）：所有化合物对COX-2的IC₅₀介于0.05–2.65 μM，对COX-1的IC₅₀介于0.29–9.51 μM。其中6个化合物（5b、5c、5d、5g、10c、10e）的COX-2抑制活性与塞来昔布相当（IC₅₀ = 0.05–0.17 μM）。化合物5b和5d的选择性指数（SI）分别为9.25和12.02，优于其他化合物。构效关系（SAR）分析表明：1,5-二苯基吡唑系列（5a–g）的COX-2选择性普遍高于5-氨基吡唑系列（10a–e）；R₂为烯丙基或羧甲基时选择性最佳。

**2.2.2. 碳酸酐酶（CA）抑制实验**（体外实验）：所有化合物对hCA II的K_i介于39.1–102.3 nM，对hCA XII的K_i介于34.2–75.3 nM，对hCA I的K_i较高（425.8–57860 nM）。化合物5b对hCA II的K_i为39.1 nM，对hCA XII的K_i为34.2 nM，且对hCA I的选择性指数高达933.8。SAR显示：引入5-苯基（而非5-氨基）显著降低对hCA I的亲和力，提高选择性；带有极性尾链（如羧酸、巯基）的化合物对hCA XII抑制更强。

**2.2.3. 体内生物学评价**
**2.2.3.1. 镇痛活性**（大鼠热板实验）：5b和5d在10 min即产生显著镇痛作用，5d起效更快（10 min时与布洛芬无显著差异），两化合物的效应持续至90 min。
**2.2.3.2. 抗炎活性**（角叉菜胶诱导足肿胀）：5b和5d（50 mg/kg）在2 h时显著抑制水肿，于3–4 h达到最大效应，且持续至6 h。5b在5 h的抑制率略高于5d。
**2.2.3.3. 溃疡原性活性**（大鼠胃黏膜评估）：5b和5d引起的溃疡指数（UI）远低于布洛芬；5d在1 h时完全无溃疡（100%保护），24 h时UI为9.86（保护率49.8%），5b在3 h保护率50.2%，24 h保护率35.5%。
**2.2.3.4. 抗青光眼活性**（兔模型）：5b（1%溶液）局部给药后60 min显著降低IOP，且效应持续；5d（0.05%溶液）作用较弱且未达统计学显著性。

**2.3. X射线晶体学分析**：解析了hCA II与化合物10d的共晶结构（PDB: 9T4S），显示苯磺酰胺基团以去质子化形式与Zn²⁺配位，并与Thr199形成氢键；吡唑氨基与Thr200氢键；硫代烯丙基尾链伸向Phe20形成的疏水口袋。

**2.4. 分子建模**
**2.4.1. 分子对接**（Glide SP）：5b和5d在hCA II和COX-2中的对接得分与参考配体（乙酰唑胺、塞来昔布）相当。5b在hCA II的得分为–8.05 kcal/mol，5d在COX-2的得分为–10.10 kcal/mol。结合模式显示磺酰胺与Zn²⁺、Thr199/Thr200作用，吡唑/噁二唑环与Gln92、Asn67等形成氢键，苯环与Phe131形成π-π堆积。
**2.4.2. 分子动力学模拟**（200 ns）：RMSD波动在1–2.5 ?之间，关键相互作用（Zn²⁺配位、氢键、π-π堆积）在模拟中大部分保持稳定，证实了对接所预测的结合模式。

#### 讨论与结论

研究结论部分总结如下：研究人员设计、合成并生物评价了一系列新型磺酰胺衍生物5a–g和10a–e。体外环氧化酶抑制实验显示，多数化合物对COX-2具有增强的选择性，其中5b、5c、5d、5g、10c和10e表现出与塞来昔布相当的COX-2抑制活性（IC₅₀ = 0.05–0.17 μM）。化合物5b和5d是最有前景的候选物，具有高选择性指数（SI分别为9.25和12.02）。碳酸酐酶抑制研究表明，5b是hCA II亚型的选择性抑制剂。基于优越的体外活性，5b和5d进行了体内评价，结果显示有前景的镇痛和抗炎活性，起效相对迅速且作用时间延长。重要的是，溃疡原性研究显示5b和5d的胃安全性显著改善，但这些发现为初步结果，需进一步药理学确认。此外，在兔青光眼模型中，5b表现出统计学显著且持久的眼内压降低作用，优于5d，凸显了其作为降压药剂的潜力。本研究未评估对hCA IV的抑制活性，这是参与房水生成的重要靶点，因此5b的抗青光眼机制需通过hCA IV抑制研究进一步验证。最后，通过整合分子对接和动力学研究，获得了合成的化合物与靶酶结合构象和关键分子相互作用的见解。总之，化合物5b展现出良好的药效和安全性，并具有增强的抗青光眼活性。