微波辅助合成6,N2-二取代1,3,5-三嗪-2,4-二胺及其抗癌活性评价

《Journal of Molecular Structure》：Microwave-assisted synthesis of 6,N2-disubstituted 1,3,5-triazine-2,4-diamines and evaluation of their anticancer activity

　　

1,3,5-三嗪环体系已被认为是开发多种生物活性化合物的有前景骨架。该杂环体系已被用于构建具有多样生物学性质的化合物，其应用范围从杀虫活性到药理学应用，潜在用途包括抗病毒、抗菌、抗真菌、抗阿尔茨海默病以及抗癌药物。6,N₂-二取代1,3,5-三嗪-2,4-二胺已被发现对癌症及若干癌症相关靶点，尤其是酶，具有活性。代表性实例包括溶血磷脂酸酰基转移酶抑制剂CT-32228和CT-32176，以及多激酶抑制剂SJ5000516613和SJ000517729。另一种有前景的化合物是泛素结合酶抑制剂SMI#9，其对三阴性乳腺癌细胞具有活性。

已有多种6,N₂-二取代1,3,5-三嗪-2,4-二胺的合成方法被报道。其中最常见的策略之一是利用三聚氯氰中氯原子的连续亲核取代。该反应序列可由Grignard试剂替换一个氯原子起始，随后与取代胺和氨反应；另一种方式是先引入氨基，再通过Suzuki偶联反应与硼酸偶联。Grignard试剂的高反应活性使其在操作和选择性控制方面面临挑战。Suzuki偶联法通常更具实用性，但底物范围存在限制，无法向三嗪环引入烷基。另一种方法是使氰胺钠与芳基异硫氰酸酯反应生成N-氰基硫脲衍生物，再与芳基脒反应制得目标化合物。另有报道采用胍与2-酰亚胺基-3-芳基-1,3-噻氮杂环丁烷反应合成该类化合物。由氰基胍和胺制备双胍，再与羧酸衍生物反应，也是合成6,N₂-二取代1,3,5-三嗪-2,4-二胺的成熟且广泛应用的方法，其变体还包括钌催化双胍与苄醇的反应。然而，这些方法均受多步骤流程限制。为避免这一问题，研究人员此前已开发出一种在微波辐照条件下，由氰基胍、芳香醛和芳香胺进行多组分反应的一锅法合成策略。该方法适用于多种胺底物，但醛组分范围有限，只有芳香醛能够生成目标化合物，而尝试利用芳基乙醛在三嗪环6位引入亚甲基连接桥则未获成功。亚甲基桥带来的柔性有助于芳基更有效地占据结合口袋。因此，研究人员开发并报道了一种可进一步扩展6,N₂-二取代1,3,5-三嗪-2,4-二胺结构多样性的替代方法，其中包括在三嗪6位带有(杂)芳甲基取代基的化合物。

该论文发表于《Journal of Molecular Structure》，围绕6,N₂-二取代1,3,5-三嗪-2,4-二胺这一具有明确药理开发价值的杂环骨架，建立了一条新的合成路线，并结合晶体结构解析与体外抗增殖筛选，对其化学可及性和初步抗癌潜力进行了系统评估。1,3,5-三嗪骨架因其电子缺陷特征、结构可修饰性以及在多类生物活性分子中的广泛分布，长期被视为药物化学中的重要优势骨架。既有研究已表明，6,N₂-二取代1,3,5-三嗪-2,4-二胺可作用于多种癌症相关靶点，尤其是酶类，并在三阴性乳腺癌等肿瘤模型中表现出应用潜力。然而，传统合成策略通常依赖多步反应，如三聚氯氰连续亲核取代、双胍与羧酸衍生物缩合、异硫脲或脒类中间体构建等，存在试剂活性过高、底物适用性不足、难以引入某些烷基或(杂)芳甲基片段等问题。此前报道的一锅多组分微波法虽提升了操作便捷性，但在醛组分范围方面仍受限制，尤其难以实现三嗪6位亚甲基连接的(杂)芳基导入。基于这一合成瓶颈，研究人员开展本研究，旨在发展一种更直接、原子经济性更高且可扩展底物范围的新方法，以获得更丰富的6,N₂-二取代1,3,5-三嗪-2,4-二胺化学空间，并为后续抗癌构效关系研究提供分子基础。

在方法学层面，研究人员建立了N-芳基取代氰基胍与腈在微波辐照下发生[4+2]环加成构建1,3,5-三嗪环的新反应。该过程以100%原子经济性为特点，直接生成目标6,N₂-二取代1,3,5-三嗪-2,4-二胺。模型反应以N-(4-甲基苯基)氰基胍与苯乙腈为底物，经条件筛选后确定：以乙醇为溶剂、氢氧化钾1当量、170 °C、微波反应30 min为较优条件。在此基础上，研究人员考察了多种N-芳基氰基胍与不同类型腈底物，包括芳基乙腈、苯甲腈以及杂芳腈，证明该方法能够制备一系列目标化合物，尤其适用于合成既有方法难以获得的6-(杂)芳甲基取代衍生物。随后，研究人员采用核磁共振（NMR）波谱确认结构，并对代表化合物1g进行X射线衍射（XRD）分析，以阐明其分子构型与晶体堆积特征。最后，以三阴性MDA-MB-231乳腺癌细胞为模型，采用MTT法测定各化合物72 h处理后的GI₅₀，评价其抗增殖活性。

主要技术方法概括：研究人员采用微波促进有机合成，以N-芳基氰基胍和腈发生[4+2]环加成构建1,3,5-三嗪骨架，并通过反应条件优化明确碱、溶剂、温度和时间的影响；利用¹H NMR与¹³C NMR进行结构表征；选取代表化合物1g开展单晶X射线衍射（XRD）解析其分子构象及超分子相互作用；以MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞为单一筛选队列，采用MTT法和GraphPad Prism 8计算GI₅₀，甲氨蝶呤作为阳性对照。

2.1. Synthesis
在“合成”部分，研究人员首先依据以往微波促进三嗪环构建的经验，提出利用N-取代氰基胍与腈直接发生[4+2]环加成来制备目标化合物。模型反应结果显示，无碱条件下产率较低，而加入氢氧化钾后反应显著改善，其中1当量氢氧化钾效果最佳，产物1a分离收率达到53%。减少或增加碱用量均导致收率下降，氢氧化钠也不优于氢氧化钾。温度、时间及溶剂考察表明，乙醇优于其他醇类与聚乙二醇400，微波加热亦优于常规加热。底物拓展结果证明，该方法可兼容多种芳基乙腈、苯甲腈和杂芳腈，成功合成1a-h、1i-n和1o-t等多个目标分子。文章指出，部分底物仅得到中等收率，但该路线可获得一些替代方法无法合成的化合物，特别是6-(杂)芳甲基取代产物。研究人员还指出，(杂)芳基乙腈底物收率偏低，可能与其结构中的酸性氢引发副反应有关；而6位连有缺电子杂环时，强碱高温条件下三嗪碳原子亲电性增强，可能导致水解，从而降低目标产率。基于波谱分析，目标分子的三嗪环碳在¹³C NMR中呈现164.0–176.8 ppm的特征信号，6位亚甲基在¹H NMR中出现在3.64–3.92 ppm，在¹³C NMR中位于38.9–44.5 ppm，2位连接芳环的氨基质子则明显低场位移至9.26–9.83 ppm。对于反应机理，研究人员提出先由碱将氰基胍去质子化形成强亲核中间体A，随后加成至腈的三键生成中间体B，再经环化、质子化和互变异构得到最终三嗪产物。

2.2. X-Ray crystallography
在“X射线晶体学”部分，研究人员选取代表性化合物1g进行单晶结构分析。结果显示，其晶体不对称单元中包含3个独立分子，其中两个分子的2-噻吩基存在无序现象。整体上，分子由中心1,3,5-三嗪环以及伯胺、4-甲基苯胺和2-噻吩甲基取代基构成。非无序主分子中的三嗪环近乎平面，而三嗪环与外侧六元环、五元环之间均存在较大二面角，说明分子呈明显扭曲构象；不同独立分子间的二面角差异则表明其构象紧凑程度不同，其中分子(b)更为紧凑。键长分析表明，三嗪环内C-N键处于典型单键与双键之间，提示C₃N₃骨架上存在显著π电子离域；C2–N5键相对较短则说明离域效应延伸至仲胺部分，而C3–C11键则表现为正常单键长度。晶体堆积方面，研究人员观察到广泛的传统N–H···N氢键以及其他非共价作用。主分子与分子(a)可通过伯胺N–H···N(azine)和仲胺N–H···N(azine)氢键组装成链状超分子结构，形成非对称八元超分子合成子{···NCNH}₂；分子(b)也形成相似链，但其组装方式与对称关系存在差异。除N–H···N作用外，未参与该氢键的胺氢还可形成N–H···π(phenyl)相互作用；不同链之间则通过C–H···N、π···π堆积和C–H···π作用进一步构筑层状超分子结构，沿c轴堆叠。该部分结果从固态层面证实了目标化合物的精确结构，并揭示了其多样非共价相互作用模式。

2.3. Antiproliferative activity
在“抗增殖活性”部分，研究人员将所制备化合物应用于MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞的体外筛选。化合物测试浓度范围为0.0004–200 μM，并测定GI₅₀。结果表明，不同取代模式对活性影响显著。对于6-苯基环对位卤素取代的化合物，N₂-苯环对位甲基取代可明显增强活性：1j和1k的活性约为未带该甲基类似物1i的7倍。全系列中，6位带2-噻吩基的1r表现最佳，GI₅₀为0.07 μM，活性接近阳性对照甲氨蝶呤（GI₅₀=0.02 μM），因此被确定为后续研究的有前景先导化合物。值得注意的是，在1r类似物中，N-苯环对位取代会使活性显著下降，1s和1t均显示远弱于1r的抗增殖效应。此外，将噻吩与三嗪之间改为亚甲基连接的1g和1h，其活性与1s和1t相近。该成对比较未能显示亚甲基连接对活性具有明确优势，但提示含该结构特征的化合物仍值得在更广阔化学空间中继续探索。研究人员同时强调，由于本研究初筛仅限于MDA-MB-231细胞，尽管结果支持这些化合物具有进一步开发价值，但仍需在更多癌细胞系及非癌细胞中开展选择性评价。

讨论与结论总结：论文的讨论部分集中于新合成路线的化学适用性、结构确认和初步生物活性之间的关联。研究表明，微波辅助的N-芳基氰基胍与腈[4+2]环加成反应，能够在较短时间内、无需柱色谱分离地制备多种6,N₂-二取代1,3,5-三嗪-2,4-二胺，尤其补足了既有方法在6-(杂)芳甲基取代物构建上的不足。尽管若干底物仅获得中等或偏低收率，但该方法具备底物范围较广、操作简便和原子经济性高等优点。生物学评价则提示，6位2-噻吩取代的三嗪骨架对MDA-MB-231细胞具有较突出抑制潜力，其中1r最具代表性。与此同时，现有构效关系信息仍不足以判定亚甲基连接桥对抗癌活性的具体作用，因此后续仍需扩充化合物库并开展更系统的构效关系与选择性研究。

研究结论翻译：总之，研究人员开发了一种新的6,N₂-二取代1,3,5-三嗪-2,4-二胺合成方法，即在微波辐照条件下通过N-芳基取代氰基胍与腈的环加成反应实现目标骨架构建。该方法基于100%原子经济过程，能够兼容多样底物，尽管部分反应收率为中等，但弥补了既有方法的局限，扩展了生物活性6,N₂-二取代1,3,5-三嗪-2,4-二胺的化学多样性。其主要优势在于可方便制备现有方法难以获得的化合物，且具有反应时间短、无需柱色谱分离等特点。在抗增殖活性筛选中，研究人员鉴定出N₂-苯基-6-(2-噻吩基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺（1r）可作为后续开发靶向三阴性癌症药物的有前景先导化合物。现有构效关系数据尚不足以明确亚甲基连接对抗癌活性的作用，但所建立的合成方法及初步筛选结果可用于指导后续6,N₂-二取代-1,3,5-三嗪-2,4-二胺化合物库的扩展，并支持更深入的构效关系研究、更广泛的抗增殖筛选以及选择性评价。