《Journal of Neuroscience Methods》：Rapid generation of human sensory neurons from iPSC for modeling of peripheral neuropathies
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麦迪逊·E·詹姆斯|塞雷娜·西普伊·陈|贝蒂·胡|穆罕默德·H·法拉•高效分化人类感觉神经元。•c-纤维的生成。•感觉神经元分化方案的比较。•利用hiPSC衍生的感觉神经元评估神经病变模型。引言细胞重编程技术的进步使得能够从iPSCs中获得患者特异性的神经元（Takahashi等
麦迪逊·E·詹姆斯|塞雷娜·西普伊·陈|贝蒂·胡|穆罕默德·H·法拉
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高效分化人类感觉神经元。
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c-纤维的生成。
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感觉神经元分化方案的比较。
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利用hiPSC衍生的感觉神经元评估神经病变模型。
引言
细胞重编程技术的进步使得能够从iPSCs中获得患者特异性的神经元（Takahashi等人，2007a；Takahashi等人，2007b）。患者来源的iPSCs是研究人类疾病发病机制以及测试潜在治疗药物的宝贵资源（Sandoe和Eggan，2013；Wainger等人，2015；Batista等人，2020；Dadheech和James Shapiro，2019；Kim等人，2020；Stoklund Dittlau等人，2023；Szebenyi等人，2021）。对于那些由基因缺陷引起的神经系统疾病而言，患者来源的iPSCs堪称变革性技术，它们为发现潜在疗法奠定了基础（Allison等人，2024；Clark等人，2021；Mazzara等人，2020；Penney等人，2020）。
近期，人们已经从多发性神经退行性疾病的患者身上提取iPSCs，并成功培育出具有这些疾病病理特征的神经元，这类疾病包括帕金森病、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化症（Penney等人，2020；Schulze等人，2018；Fujimori等人，2018）。此外，对于那些病因不明的神经病变，比如糖尿病周围神经病变和化疗引起的周围神经病变，若能高效地培育出可承受毒性物质或代谢压力的人类感觉神经元，将为研究这类疾病提供有力工具。
我们在表1中总结了以往关于利用iPSCs模拟遗传性和获得性神经病变的研究及其所使用的细胞系来源。通常，研究化疗引起的周围神经病变时，会使用健康个体的iPSCs，以此观察化疗药物带来的神经毒性作用并揭示该病的发病机制。目前已有多种化疗药物被用于此类研究，包括硼替佐米、顺铂、紫杉醇和长春新碱（Hrstka等人，2021；Xiong等人，2021；Huehnchen等人，2022；Snavely等人，2022；Tsai等人，2022；Mortensen等人，2024；Mortensen等人，2022；Hew等人，2025）。有一项研究使用了乳腺癌患者外周血单核细胞培养得到的iPSCs来模拟紫杉醇的毒性作用。另外，还有研究通过用多种SARS-CoV-2病毒株感染健康的iPSCs系，来模拟该病毒引发的神经病变（Flamier等人，2023）。
hiPSC衍生的感觉神经元也被用于模拟糖尿病周围神经病变。这种疾病的典型病理表现为神经纤维的肿胀和扭曲，最终会导致周围神经末梢的缺失。这些特征可以通过分析皮肤活检样本中的表皮神经纤维密度来轻易量化（Ebenezer等人，2007；Gibbons等人，2006；相关联合工作组，2010；Lauria等人，2010；Lauria等人，1998；Polydefkis等人，2004）。可重复的皮肤活检操作流程的建立，提高了对人类糖尿病患者神经病变进展情况的评估准确性。当面对葡萄糖刺激时，iPSC衍生的感觉神经元可能会出现轴突功能异常或退化，这一现象也支持了糖尿病会引发神经退化的观点。不过，目前尚未有研究深入探讨糖尿病周围神经病变的精准建模，尤其是糖尿病患者来源的感觉神经元与皮肤之间的相互作用。通过将糖尿病患者的皮肤组织与轴突共同培养，这种方法可以检测糖尿病患者皮肤表皮内的轴突退化情况，进而说明糖尿病皮肤会通过营造不利于轴突生长的环境来诱发神经退化。目前仅有的一项研究使用iPSC衍生的感觉神经元来模拟糖尿病周围神经病变，该研究阐述了2型糖尿病神经病变过程中FBF13/Nav1.7蛋白相互作用复合物的双向调控机制（Singh等人，2025）。
具有感觉功能缺陷的遗传性神经病变也可通过患者来源的iPSCs进行建模。例如，已有三个iPSC系被用来模拟1型遗传性感觉神经病变（HSN1）（Clark等人，2021）。研究HSN1发病机制的学者们发现，补充L-丝氨酸可以有效缓解HSN1 iPSC模型中的诸多功能障碍，这说明L-丝氨酸可能具有治疗潜力（Clark等人，2021）。还有多个研究小组尝试模拟弗雷德里希共济失调症（FRDA），这是一种由于脊髓和周围神经中的神经纤维受损而导致的神经系统进行性损伤的罕见疾病（Mazzara等人，2020；Viventi等人，2021；Yang等人，2025；Cheah等人，2023；Dionisi等人，2020）。这些研究都使用了患者来源的样本来构建FRDA疾病模型（见表1）。此外，其他一些罕见的遗传性神经病变，比如由机械敏感离子通道PIEZO2的功能丧失突变引发的疾病，也同样可以通过iPSC衍生的感觉神经元来建模（Nickolls等人，2020）。
目前已有多种方法被用于模拟疼痛和痛觉感受。为了研究痛觉感受器的特性并评估其功能，人们使用了各种健康的iPSC系，这些细胞系既可以由研究人员自行培育，也可以从商业机构购买（Singh等人，2025；Eberhardt等人，2015；Chase等人，2022；Holzer等人，2022；Neureiter等人，2022；Deng等人，2023；Liu等人，2024；Shin等人，2024；Zurek等人，2024；Fofie等人，2025）。这些研究涵盖了炎症性疼痛、外周镇痛以及慢性疼痛等不同类型的疼痛模型。而对于遗传性疾病，比如遗传性红痛病、镰状细胞病和法布里病，研究人员则通常从皮肤成纤维细胞或外周血单核细胞中培育患者专用细胞系，以便在体外更准确地模拟这些疾病（Allison等人，2024；Cao等人，2016；Meents等人，2019；Mis等人，2019；Klein等人，2024；Shim等人，2025）。
利用iPSC衍生的感觉神经元，人们也成功构建了瘙痒感的模拟模型。表1中列出的两项研究都使用了来自成纤维细胞的iPSCs，其中一项用于研究特应性皮炎，另一项则用于构建组胺依赖性的瘙痒模型（Tay等人，2024）。
此前已有许多研究者成功从iPSCs中培育出感觉神经元。人类iPSC衍生的感觉神经元及其相应的分化方案，已经在基因表达谱和功能检测方面得到了系统研究，相关总结见表2。我们共回顾了12项关于感觉神经元分化方案的研究。这些研究中所采用的培育成熟感觉神经元的时间长度差异很大，从14天到42天不等。现有的分化方法主要分为两类：一类是采用小分子诱导分化的方法（Chambers等人，2012），另一类则是Anatomic Incorporated公司推出的“加速”分化方法。常规的分化方案通常首先引导干细胞向神经嵴细胞方向发展，随后再逐步培育出成熟的感神经元，而整个过程往往需要数周时间。鉴于不同分化方案所需的培育时间差异较大（最长可达42天），在本研究中，我们介绍了一种快速且高效的方法——仅需10天即可利用不会留下遗传痕迹的mRNA将人类iPSC培育成成熟的感神经元。一种高效且标准化的感觉神经元培育方案，对于推动神经病变模型的发展以及促进相关疗法的研发具有重要意义。
章节要点
iPSC的维持
我们采用了Ricoh Biosciences和AMSBIO提供的方案，对两个健康的对照iPSC系（JHMI的Ansari ALS Stem Cell Core）进行了维护。这些干细胞被培养在涂有iMatrix（Ricoh Biosciences产品编号NI511S）的6孔培养板上，每周会用TrypLE-Select（ThermoFisher产品编号12563011）与EDTA（Sigma-Aldrich产品编号E8008–100mL）的混合液对培养板进行清洗，以此维持细胞系的稳定性。培养基会在周一和周三更换，周五则会进行两次或三次更换，这样就能避免在周末更换培养基。
感觉神经元分化方法
表2中列出了多种基于iPSCs的感觉神经元分化方案。不过，现在已经有新的基于mRNA的分化方法出现，这类方法所需时间更短，且可应用于包括感觉神经元在内的多种细胞类型。我们测试了一种新的基于mRNA的分化方法，该方法无需留下遗传痕迹，即可将iPSCs分化为感觉神经元。具体来说，我们使用了Ricoh Biosciences公司的Quick Neuron? Sensory-mRNA试剂盒，该试剂盒成功实现了……
讨论
在本研究中，我们提出了一种高效且稳健的方法，只需10天即可将人类iPSC培育成成熟的感神经元，这一速度远远快于表2中提到的传统分化方案（传统方案所需时间为14至42天）。这种快速分化方案有望加快我们对小纤维神经病变的理解速度，也有助于寻找相关治疗手段，尤其是针对那些病因不明的获得性神经病变，比如糖尿病周围神经病变和化疗引起的周围神经病变。
这种感觉神经元分化方法能够……
CRediT作者贡献说明
贝蒂·胡：验证、软件应用、实验资源准备、项目管理、方法设计、实验实施、正式数据分析、数据整理。塞雷娜·西普伊·陈：论文撰写——审稿与编辑、论文撰写——初稿编写、结果可视化、实验实施、正式数据分析、数据整理。麦迪逊·E·詹姆斯：论文撰写——初稿编写、验证、实验实施、正式数据分析、数据整理、概念构思。法拉·穆罕默德：论文撰写——审稿与编辑、论文撰写——初稿编写、结果可视化、验证、研究指导。
作者贡献
M.E.J.、S.C.、B.H.和M.H.F.共同设计了细胞培养实验并实施了相关操作。S.C.和M.H.F.在所有列出的作者的共同指导下完成了论文的撰写工作。
资金支持
本研究得到了马里兰干细胞研究基金（项目编号2025-R2-MSCRFD-00028，资助人M.H.F.）以及美国国立卫生研究院的资助（项目编号R21NS130900，资助人M.H.F.；项目编号R21NS125783，资助人M.H.F.）。
致谢
我们要对已故的Erin Beebe在技术支持方面给予我们的帮助表示衷心的感谢，同时也要感谢Jody Liu在技术层面提供的协助。此外，我们还要感谢神经科学多光子成像研究中心在成像工作上给予我们的支持。
