拮抗剂KH-5对毒蕈碱受体的双位点与双重作用调节

《British Journal of Pharmacology》：Dualsteric and dual-acting modulation of muscarinic receptors by antagonist KH-5

　　

背景与目的：毒蕈碱乙酰胆碱受体（Muscarinic Acetylcholine Receptors, mAChRs）是重要的治疗靶点，同时结合正构位点（orthosteric site）和变构位点（allosteric site）的配体可能提供更好的选择性和效力。此处，研究人员研究了拮抗剂KH-5是否作为双位点（dualsteric）拮抗剂，并明确了其与毒蕈碱受体的相互作用模式。实验方法：在表达人M1和M2受体的CHO细胞中，分别通过磷酸肌醇（inositol phosphate, IP）积累和[³⁵S]GTPγS结合评估功能反应。放射性配体结合研究使用正构拮抗剂和激动剂联合KH-5以及经典变构调节剂。数据采用竞争性、变构性和双位点结合模型以及操作模型进行分析。分子对接、分子动力学模拟和定点诱变用于识别KH-5结合的结构决定因素。关键结果：KH-5以可饱和和探针依赖的方式拮抗多种激动剂的反应，但不降低激动剂的最大反应，这与简单的变构拮抗作用相矛盾。在M2受体，拮抗作用主要是竞争性的。结合研究显示，在纳摩尔浓度KH-5下，M1受体激动剂结合短暂增强，最好用涉及独立正构和异位（ectopic）位点相互作用的双位点结合模型描述。KH-5不与第二胞外环上的经典毒蕈碱变构位点结合，而是与胞外前庭（extracellular vestibule）位点相互作用。结论与意义：在M1受体，所测试模型中最简约的模型将正构竞争与异位/变构组分结合。在M2受体，在现有条件下KH-5主要表现为正构拮抗剂，尽管不能排除弱或探针特异性的变构组分。

**论文解读：KH-5对毒蕈碱受体的双位点与双重作用调节机制**

**研究背景与科学问题**

毒蕈碱乙酰胆碱受体（Muscarinic Acetylcholine Receptors, mAChRs）家族包含M1至M5五个亚型，广泛分布于中枢和周围神经系统，介导多种重要生理功能，如学习记忆、运动控制、心血管稳态等。由于正构位点（orthosteric site）在各亚型间高度保守，传统非选择性拮抗剂虽在治疗癫痫、帕金森病、抑郁症、膀胱过度活动症及慢性阻塞性肺疾病中有效，但常伴随认知障碍、视力模糊等副作用。因此，开发亚型选择性药物成为热点。变构配体（allosteric ligands）或双位点配体（dualsteric ligands）——即同时结合正构位点和变构位点的分子——可能通过结合非保守的变构位点提高选择性，同时保留正构位点的功效。前期研究中，研究人员合成了拮抗剂KH-5，发现其功能拮抗效力显著高于其结合亲和力，提示KH-5可能通过正合作性变构调节（PAM拮抗作用）增强与激动剂-受体复合物的结合。然而，这一假说尚需系统验证——KH-5究竟是简单竞争性拮抗剂，还是涉及变构位点的双重作用剂？这一问题直接关系到双位点配体设计策略的优化。

**研究概述与结论**

本研究旨在阐明KH-5与毒蕈碱受体的相互作用模式，特别是其在M1和M2受体上的作用机制。通过功能实验、放射性配体结合、分子建模、分子动力学模拟及定点诱变，研究人员发现：KH-5在M1受体上表现为一种“双位点双作用调节剂”（dualsteric dual-acting modulator），即同时结合正构位点和变构位点，从变构位点产生正性功能合作，从正构位点产生竞争性拮抗，且两个KH-5分子之间也存在正结合合作性；在M2受体上，KH-5主要表现为竞争性拮抗剂，但弱变构组分不能排除。该研究发表于《British Journal of Pharmacology》，为设计混合正构/变构配体提供了框架，促进亚型选择性抗胆碱能药物开发。

**主要关键技术方法**

1. **功能测定**：在稳定表达人M1或M2受体的CHO细胞（来源于Missouri S&T cDNA Resource Center）中，分别通过[³H]肌醇磷酸积累（M1）和[³⁵S]GTPγS结合（M2）评估功能反应。
2. **放射性配体结合实验**：使用[³H]N-甲基东莨菪碱（[³H]NMS）、[³H]乙酰胆碱和[³H]氧化震颤素-M等放射性配体，结合竞争、变构及双位点结合模型（Equations 2-8）分析数据。
3. **分子建模与模拟**：利用YASARA进行分子对接，Desmond进行常规分子动力学（cMD）模拟（120 ns，三次重复），评估KH-5在受体异位/变构位点的结合稳定性。
4. **定点诱变**：对M1受体胞外前庭关键残基（Y82、Y85、Y179、W400、Y404）进行丙氨酸替换，瞬时转染CHO细胞后检测KH-5结合与功能变化。

**研究结果**

**3.1 功能拮抗**
在M1受体上，KH-5（31.6 nM~10 μM）剂量依赖性地右移所有激动剂（乙酰胆碱、iperoxo、氧化震颤素-M、毛果芸香碱、呫诺美林）的浓度-效应曲线，且最大反应（E_MAX）不变，但拮抗效应在微摩尔浓度下饱和，符合变构特征。Schild分析显示数据更适合变构拮抗模型（Equation 16）而非竞争模型（Equation 15），且抑制常数（pK_B）因激动剂而异（探针依赖性），提示变构组分。在M2受体上，KH-5（3.16~100 μM）引起非饱和的右移，E_MAX不变，Schild分析更符合竞争模型，但呫诺美林例外（仍显示探针依赖性）。

**3.2 结合实验**
与[³H]NMS的竞争结合实验（图5）中，KH-5与激动剂的相互作用最好用三方竞争模型（Equation 7）描述，表明KH-5主要为正构竞争者。但与[³H]乙酰胆碱或[³H]氧化震颤素-M的直接结合实验（图6）中，KH-5在纳摩尔浓度（3.16~31.6 nM）下短暂增强M1受体激动剂结合（约10%~20%），随后完全抑制，数据最适合双位点结合模型（Equation 8），正合作性因子α约1.3~1.5。在M2受体上，仅观察到抑制，符合竞争模型（Equation 2）。此外，KH-5与经典变构调节剂阿库铵（alcuronium）的相互作用（图7）表明，KH-5不与阿库铵的经典变构位点结合，而是与正构位点竞争，同时变构调节阿库铵结合，且在M2亚型上呈现正合作性（β>10）。

**3.3 分子建模**
将KH-5对接至利用M4受体（PDB: 8FX5）中呫诺美林异位结合位点定义的胞外前庭位点，所有五种亚型的非活性与活性构象中均显示可能的结合，结合能差异小于1 kcal·mol^?1，提示正构与异位位点亲和力相近。分子动力学模拟（120 ns）表明，除个别副本外，KH-5在异位位点内稳定停留，主要相互作用残基包括F/Y2.61、Y2.64、Y45.51、W7.35和Y7.39（图9），且该位点不具有与阿库铵结合位点重叠的特征。

**3.4 突变受体**
对M1受体关键残基进行丙氨酸突变：Y82A、Y85A、Y179A、W400A和Y404A。Y404A降低正构配体NMS和乙酰胆碱亲和力（24倍和3.9倍），但不影响KH-5亲和力，提示KH-5在正构位点具有不同的结合几何。Y82A将KH-5亲和力降低4倍，并消除KH-5对乙酰胆碱结合的短暂增强效应（图10）。Y404A反而增强该增强效应（α从1.69增至2.36）。这些结果证实胞外前庭残基参与KH-5的变构结合。

**3.5 操作模型**
推导了双位点调节激动作用操作模型（Operational Model of Dualsterically Modulated Agonism, OMDMA，Equation 13）。全局三维拟合表明，OMDMA优于纯竞争模型（Equation 11）或纯变构模型（Equation 12），能捕捉到KH-5在微摩尔浓度下的饱和拮抗效应。参数估计显示，KH-5对正构位点亲和力（K_C，约100 nM）高于变构位点（K_B，约10 μM），且正合作性因子α、β、δ均为正，但β和δ的估计值不确定性较大。固定α后的拟合（图11）进一步支持双位点双作用机制：KH-5从变构位点产生正性功能合作（δ>1），从正构位点产生竞争性拮抗，且两个KH-5分子之间存在正结合合作性（β>1）。

**总结与讨论**

本研究通过多维度实验证据表明，KH-5在M1受体上并非简单的变构拮抗剂或竞争性拮抗剂，而是一种双位点双作用调节剂。其作用机制可归纳为：KH-5同时结合正构位点和变构（异位）位点；从变构位点，它通过正性操作合作性（δ>1）增强激动剂的功能反应；从正构位点，它竞争性阻断激动剂功能；此外，两个KH-5分子分别结合正构和变构位点时，两者间存在正结合合作性（β>1）。这种机制解释了为何KH-5的功能拮抗效力高于结合亲和力，同时不降低最大反应。在M2受体上，KH-5主要表现为正构拮抗剂，但呫诺美林等探针提示可能的弱变构组分。该研究为设计混合正构/变构配体提供了理论框架，并强调了双位点配体在实现亚型选择性抗胆碱能药物开发中的潜力。

**研究结论（翻译）**：在M1受体，所测试模型中最简约的模型将正构竞争与异位/变构组分结合。从变构位点，它正向调节对激动剂的功能反应。从正构位点，它发挥功能反应的竞争性拮抗。此外，结合到变构和正构位点的KH-5分子之间呈现正合作性。在M2受体，现有条件下KH-5主要表现为正构拮抗剂，尽管不能排除弱或探针特异性的变构组分。