综述：从方法定义信号到参考测量程序：基于质谱的ProGRP定量二十年进展

《Journal of Proteome Research》：From Method-Defined Signals to Reference Measurement Procedures: Two Decades of Mass Spectrometry-Based ProGRP Quantification

　　

胃泌素释放肽前体（ProGRP）是临床公认的小细胞肺癌（SCLC）及其他神经内分泌肿瘤（NENs）的生物标志物。尽管临床应用广泛，但ProGRP检测面临循环浓度低及前体蛋白选择性加工导致的蛋白亚型异质性挑战。当前基于免疫测定的方法产生的是锚定于抗体-表位相互作用的操作性定义信号，而非化学明确的分子定量结果，限制了跨平台的检测结果可比性。质谱（MS）技术通过序列定义定量解决了这些局限，能够分辨序列特异的异构体，并在完整蛋白水平解析单个蛋白亚型。研究人员在本前瞻性论述中以二十年来基于MS的ProGRP定量研究为定量蛋白质组学与测量科学的案例进行分析，追溯了从单四极杆工作流程到同位素稀释策略的演变历程——该过程实现了选择性与计量学稳健性的持续提升，且性能提升主要源于选择性工程设计与内标标准化，而非质量分析器本身的进步。这一发展轨迹逐步揭示了一个根本性的可比性问题：免疫测定与基于MS的方法并未测量相同的量。解决这种不一致需要明确的计量学框架，涵盖被测量定义、溯源体系架构，以及基于蛋白水平同位素稀释质谱（IDMS）的参考测量程序（RMPs）。ProGRP可作为临床蛋白质组学中实现定量蛋白生物标志物检测标准化的示范模型。

引言

ProGRP是胃泌素释放肽（GRP）的循环前体片段，作为临床相关生物标志物，其在小细胞肺癌（SCLC）这一侵袭性肺神经内分泌肿瘤中的角色最为明确。在该领域，ProGRP已被广泛研究用于诊断支持、疾病分层、治疗监测及临床结局评估。除SCLC外，分化良好的肺神经内分泌肿瘤及甲状腺髓样癌等肺外神经内分泌肿瘤中也观察到ProGRP浓度升高。作为一种低丰度循环蛋白亚型集合，ProGRP代表了定量临床蛋白质组学的典型挑战：需要在不同平台与实验室间实现具备灵敏度、选择性及计量学严谨性的标准化检测。尽管临床应用广泛，ProGRP的分析检测仍面临固有挑战。健康人群循环浓度极低，韩国大型参考队列显示各年龄与性别组的97.5百分位数上限均低于100 pg/mL，年轻成人约为65 pg/mL，≥80岁人群约为94 pg/mL，且同年龄段女性值始终高于男性。该浓度常接近或重叠于常规免疫测定的定量下限，导致检测窗口狭窄且分析难度大。叠加的挑战在于ProGRP并非单一化学均一的分子实体，而是作为异质性蛋白亚型集合存在——即单个基因蛋白产物经遗传变异、可变RNA剪接及翻译后修饰产生的所有不同分子形式，由前体蛋白的选择性加工生成。低循环浓度与蛋白亚型异质性共同构成了分析特异性与结果可比性的重大关联挑战，尤其当检测结果用于支持不同实验室、平台及时间点的临床决策时。当前ProGRP主要依赖免疫测定方法检测，此类方法虽具备高灵敏度、高通量及操作简便的优势，但其检测原理本质基于抗体-表位相互作用，产生的信号反映的是免疫反应性而非精确定义的分子数量。交叉反应、表位可及性差异及ProGRP蛋白亚型的识别差异导致方法依赖性结果，难以标准化。关键试剂生产的变异性也会导致免疫测定技术性能随时间推移出现波动。因此，免疫测定提供的是复合且模糊的分析信号，其中贡献于报告浓度的确切分子种类大多未明。在精准医学背景下——分子特异性、溯源性与结果可比性需求日益提升——这种清晰度缺失并非次要技术缺陷，而是根本性局限。质谱已成为应对上述多项局限的有力替代分析平台。通过靶向确定的分子种类（最常用酶解后生成的蛋白特征肽段），基于MS的方法提供了免疫测定根本无法企及的分子特异性水平。重要的是，MS能够区分并定量序列特异的ProGRP异构体，原则上也可定量完整ProGRP蛋白亚型，从而获得常规临床检测中被掩盖的分子信息。从分析化学视角看，这种特异性是决定性优势，将检测从抗体依赖型信号转变为化学定义的被分析物。然而，基于MS的ProGRP检测从研究场景向常规临床实践的转化并非易事。分析复杂性、成本及通量相关的挑战历史性地限制了其在以自动化免疫测定平台为主的临床实验室中的应用。过去二十年，基于MS的ProGRP定量开发经历了一系列旨在克服这些障碍的方法学与概念转型。早期依赖非选择性样品制备的工作流程逐步被靶向亲和富集策略（包括免疫捕获与分子印迹聚合物）取代，以提升灵敏度并降低基质效应。与此同时，色谱分离、串联质谱及数据采集策略的进步显著增强了分析稳健性。该演变中尤为关键的步骤是稳定同位素稀释方法的引入。同位素标记内标的运用提升了精密度与重复性，凸显了MS超越相对或方法特异性定量、迈向高阶测量原理的潜力。在此背景下，同位素稀释质谱（IDMS）不仅是技术优化，更是连接分析化学与计量学的概念桥梁，可实现对损失、酶解效率及仪器变异性的明确校正。同时，不断积累的基于MS的ProGRP研究揭示了一个关键且常被忽视的问题：不同分析平台即便名义上报告“ProGRP浓度”，也未必测量相同的量。免疫测定与基于MS的方法锚定于根本不同的被测量——免疫反应性对阵确定分子实体——因此产生的相关性结果并不具备直接互换性。这种差异并非任一平台的分析失败，而是反映了缺乏能够将不同测量原理关联至共同参考的共享计量学框架。从测量科学角度看，这种标准化缺失是ProGRP结果临床可比性的核心障碍。若无明确定义的被测量、可追溯的校准层级及互通性参考物质，不同实验室或平台获得的数值即使用于指导相似临床决策，也无法解释为等效结果。随着ProGRP临床应用从诊断扩展至治疗监测与纵向随访，这一局限愈发凸显。本前瞻性论述以ProGRP为代表性示范案例，阐明分析化学（尤其是质谱）的进步必须与明确的计量学概念相结合，才能实现蛋白生物标志物检测的真正标准化。研究人员并非提供详尽的方法学综述，而是聚焦于基于MS的ProGRP定量的概念演变，强调从肽中心工作流程到同位素稀释策略的关键转型。研究人员主张，开发参考测量程序（RMPs）——可能基于完整蛋白标准品与明确定义的被测量——是实现国际可比且具临床解释性的ProGRP检测的合理下一步。更广泛而言，本文讨论的挑战与解决方案并非ProGRP独有，而是体现了分析化学与临床实践交界层面蛋白生物标志物定量存在的共性问题。

范围与前瞻视角

本前瞻性论述批判性审视基于质谱的ProGRP检测方法的概念演变，并非按时间顺序逐法回顾，而是作为分析设计与计量学决策的案例研究。研究人员分析了样品制备、亲和富集及同位素稀释策略的连续创新如何逐步提升分析性能，同时也揭示了与被测量定义、溯源性及结果可比性相关的基本局限。研究重点并非确定单一“最佳”方法，而是阐明为何不同分析路径产生不可互换的结果，并概述关键的计量学要求——尤其是参考测量程序的开发——这是基于MS的ProGRP定量支持标准化临床解读必须解决的问题。

证据基础与筛选依据

研究人员通过聚焦基于质谱的ProGRP定量的文献开展了结构化检索。相关研究的识别依托PubMed、Scopus及Web of Science数据库，检索词组合涵盖ProGRP、LC-MS、定量质谱、同位素稀释及生物标志物检测。检索最后更新于2026年3月，旨在纳入具有代表性的方法学定义研究。研究目的并非穷尽覆盖，而是识别方法学上具有代表性及概念上有影响力的成果，以阐释基于MS的ProGRP检测随时间的演变，以及不同分析选择如何影响报告结果。所选研究共同聚焦于临床相关基质（主要是人血清或血浆）中ProGRP的定量测定，整体覆盖了过去二十年间出现的主要分析策略。这些策略在样品制备理念、亲和富集（含抗体依赖与非抗体依赖）、酶解流程、内标方法及质谱检测模式等方面存在差异。缺乏定量组分、采用非人或人工基质，或仅边缘涉及ProGRP的研究被视为背景信息，未纳入核心分析框架。研究人员将入选文献视为分析设计与计量学决策的案例研究，而非性能排名条目。针对每项研究，关注点不仅包括报告的性能指标（如灵敏度、精密度、准确度），还包括被测量的隐含定义、同位素稀释的应用层级，以及预分析与方法学损失的受控程度。这种方法使得方法学异同的影响可在结果可比性层面得到阐释，而非仅局限于分析性能。为支持讨论，入选工作流程的关键特征总结于比较表中。表1突出主要方法学路径，聚焦样品制备、富集策略及MS检测。表2汇总报告的分析性能特征，便于跨方法进行定性比较，同时强调其潜在假设。详细仪器条件见补充表S1以供完整性参考，但本论述的核心重点在于这些方法的概念意义，而非详尽的技术参数罗列。

基于质谱的ProGRP定量的概念演变

ProGRP相关研究为质谱蛋白定量提供了示范性案例，证明分析性能极少由质量分析器单独决定。跨越二十年的方法开发——涵盖单四极杆、三重四极杆LC-MS平台，以及近年来的高分辨率精确质量（HRAM）平台（如Orbitrap系统）——最显著的性能提升反而源自上游的分析设计。具体而言，性能增益源于选择性架构的改变（从非选择性蛋白沉淀到基于抗体的合成亲和富集）、分析靶点的精细化（从意图代表“总ProGRP”的替代肽段，到异构体分辨与序列分辨的肽段读数），以及内标策略的演变（从无内标、结构类似物，最终发展到通过明确校正过程损失的同位素稀释）。若将基于MS的ProGRP检测解读为测量科学发展轨迹而非仪器的时序序列，则可发现一致规律：跨平台与工作流程实现的灵敏度与精密度提升，始终伴随着对“不同分析配置操作性定量不同被测量”的认知深化。因此，不同MS平台获得的数值（如三重四极杆上的免疫捕获-LC-MS/MS与高分辨系统上的无抗体IDMS工作流程）可能存在相关性，但在缺乏共享被测量与溯源框架的情况下仍不具备互换性。从这个意义上说，该领域已从可行性问题（“能否在临床基质中通过MS检测并定量ProGRP？”）转向可比性问题（“被测量是什么？以及在何种条件下该量可实现跨平台、跨实验室及临床情境的传递？”）。表1总结了里程碑式的基于MS的ProGRP工作流程，强调分析设计选择如何隐含定义被测量并决定所实现的计量学控制程度。

灵敏度主要由选择性工程驱动

早期MS方法确立了可行性，但也证明临床相关ProGRP检测的限速因素并非MS灵敏度本身。主导瓶颈是基质复杂性、低被分析物丰度及多步工作流程中回收率控制不佳。Winther等人报道的首个单四极杆策略柱上检出限达13.9 pg，该水平仅适用于浓度显著升高的样本，不足以支持广泛的临床应用——临床决策常发生于更低浓度区间。从概念上看，这些早期研究阐明了一个至今仍成立的观点：对于痕量蛋白生物标志物，有效分析灵敏度常由检测器上游的能力决定，即从生物基质中分离相关分子信号的能力。决定性转折点是亲和富集策略的采用，其提升了有效选择性并降低了离子抑制。96孔板免疫捕获联合固相萃取将MS读数的检测限推进至临床相关范围（定量下限达亚ng/mL级），这是一项实用突破——临床基质中可达灵敏度的阶跃式提升，无法通过色谱或仪器优化单独实现。在ProGRP案例中，亲和富集不仅是“便捷步骤”，更是选择性架构的测量赋能转变，实质性提升了有效灵敏度，将分析能力不足的工作流程转化为可切实对接临床浓度范围的方案。同时，合成亲和材料的探索引入了概念上重要的替代方案：通过化学而非免疫识别构建选择性。用于酶解后富集的分子印迹聚合物（MIPs）展示了肽段水平捕获如何提供操作稳健性与潜在的可规模化生产优势。然而，这些无抗体方法也凸显了ProGRP的重要细节：肽段水平富集可简化流程，但无法自动满足低内源性浓度与真实基质中样品损失带来的灵敏度需求。因此，表观灵敏度轨迹应被解读为方法学进展的定性证据，而非异质报告框架下的严格定量排序。若未统一进样体积、提取富集回收率、酶解产率、基质依赖性离子抑制及校准策略等关键假设，则无法跨文献比较这些数值。

异构体分辨与序列定义测量改变了分析中“ProGRP”的含义

更为深刻的转变是从通过单一共有蛋白特征肽段报告“总ProGRP”的工作流程，转向可区分序列定义ProGRP变异体的异构体分辨测量策略。异构体分辨工作流程证实ProGRP以异质性集合形式循环，且异构体相对丰度在患者间存在差异。这一观察不仅是生物学细节，更直接影响检测可比性——因为“总ProGRP”值依赖于（i）哪些分子种类贡献于检测信号，以及（ii）方法如何操作性定义并捕获这些种类。异构体特异性在分析上极具价值，因其将方法定义靶点（“ProGRP”）替换为序列定义的肽段读数。但从临床实施角度看，蛋白亚型特异性引出了关键问题：临床预期的被测量是什么（总免疫反应性、确定的肽段替代物，还是完整蛋白亚型分辨的ProGRP）？若蛋白亚型组成在个体或疾病状态间存在显著差异，意图代表“总ProGRP”的单一替代肽段可能无法作为稳定替代物。换言之，分子分辨率的提升明确了此前被视为单一被分析物的实体可能是被分析物家族。后续整合ProGRP异构体与神经元特异性烯醇化酶（NSE）定量的多重检测格式，展示了MS的第二项优势：在单一分析框架内从单分析物定量扩展至分子Panel检测的能力。然而，多重检测也使计量学问题更为凸显：随着分析读数变得更丰富且分子定义更明确，MS与免疫测定结果的差异越难通过增量优化“修正”，而更可能反映被测量本质的不同。

同位素稀释提升了稳健性，但可比性仍是计量学问题

在时间轴上，报告的重复性显著提升，这与内标法的逐步采用及样品制备的更好控制一致。早期流程通常报告约10%或更高的相对标准偏差（RSD），反映了样品处理、酶解效率及基质效应的累积变异。后期采用稳定同位素标记肽段的检测常达到符合临床实施的实验室内精密度，最新研究在明确比较免疫亲和与无抗体IDMS导向工作流程的同时，实现了约4-6%的RSD。此处需区分常被混淆的两个概念：分析稳健性与方法间可比性。同位素稀释可通过归一化仪器响应及补偿特定过程损失，大幅提升给定流程内的稳健性。然而，比较研究一致显示MS与免疫测定间存在系统性差异。观察到的系统性差异与不同的被测量（表位定义的免疫反应性对阵序列定义的MS靶点）相符，而非随机分析误差。这种区分对计量学导向的解读至关重要：偏差并不一定意味着某方法“错误”，而可能表明方法锚定于不同的量。从测量科学角度看，在缺乏（i）约定的被测量定义、（ii）关联至互通性物质的溯源链，以及（iii）能够跨平台协调校准的参考测量程序时，此类差异是可预期的。

样品体积与通量：从仅限研究到临床可行

实际限制——样品体积与通量——也发生了有意义的演变。早期方法通常需要大体积（高达约1 mL）样品，且包含酶解与离线步骤时长时端到端周期长。近期策略将样品体积降至约0.2 mL，并通过在线富集与集成酶解引入自动化，减少了手动操作时间并提升了通量。这些进展不仅是操作便利：减少样品体积可扩展至连续监测与资源有限临床场景的适用性，而自动化可降低操作者依赖性变异——这是实验室间差异的一个未被充分重视的来源。同时，ProGRP仍是分析目标与临床实用性间持续张力的典型案例。即使工作流程在操作上高效，除非嵌入涵盖被测量定义、溯源性与互通性的更广泛计量学框架，否则其结果仍是方法定义的。因此，操作可行性是应用采纳的必要条件，但对标准化而言并不充分。上述方法学轨迹得到了比较表的支持。表1涵盖了主要工作流程架构（样品制备、富集、酶解、内标及平台），表2汇总了关键报告性能参数（检出限/定量下限、动态范围、精密度及可用偏差数据）。补充表S1提供了LC-MS配置细节以保证完整性与重现性。报告的分析周期时间未在出版物间标准化，可能包含或不包含酶解/孵育步骤，因此应解读为指示性指标而非严格可比指标。本论述中的表格旨在锚定概念讨论，明确特定工作流程决策如何转化为不同的分析靶点及不同程度的计量学控制，而非作为方法排名。由于被测量与工作流程架构存在差异，报告的性能指标应解读为情境依赖性，而非跨研究直接可比。

讨论

被测量与溯源框架

本前瞻性论述的核心前提是，若不首先定义可测量对象，ProGRP结果的争议无法解决。当前实践中，免疫测定与质谱方法产生的分析结果虽然在分析上有效，却锚定于不同的量：一方面是表位依赖的免疫反应性，另一方面是序列定义的分子实体。在基于MS的工作流程中，操作性被测量最常指特定条件下酶解释放的特定ProGRP衍生肽段的物质的量浓度，而非循环完整蛋白本身。这种区分是计量学的，而非语义的，因为只有在被测量明确定义后，才能建立溯源链、互通性与结果可传递性。由此框架可见，MS不应仅被视为替代检测技术，而应作为构建基于同位素稀释原理的参考测量程序的赋能平台——前提是校准层级、预分析控制及互通性参考物质在连贯的测量系统中得到统筹解决。

被测量：从操作性信号到化学定义的数量

基于MS的ProGRP检测的演变逐步揭示，除非被测量本身明确定义，否则仅靠分析性能无法解决长期存在的平台间不一致。早期MS方法隐含采用了与免疫测定相同的概念靶点——“总ProGRP”——而实际上量化的是特定酶解条件下生成的单一蛋白特征肽段。随着分析选择性提升（尤其是亲和富集与异构体分辨工作流程的出现），ProGRP被证实并非单一分子实体，而是循环的蛋白亚型异质性集合。Torsetnes等人首次展示的异构体分辨定量代表了概念转变：MS可报告化学定义的靶点，而非复合免疫反应性信号。从测量科学角度看，这是优势，因为它用序列分辨的靶点替代了定义不清的生物标志物。同时，这也暴露了关键模糊性：“总ProGRP”值是方法依赖的建构，其数值含义随蛋白亚型组成、抗体特异性及酶解策略而变化。因此，MS与免疫测定间的数值分歧应被解读为不同可测量数量的证据，而非分析失败。这一认知对临床转化具有直接意义。若基于MS的检测继续报告肽段衍生替代物，则必须明确声明被测量（如特定条件下特定ProGRP衍生肽段的物质的量浓度）。反之，若完整ProGRP蛋白亚型是临床相关靶点，则分析策略必须相应进化。无论哪种情况，被测量定义并非学术练习，而是溯源链、可比性与临床解读的基础。正如自上而下蛋白质组学的综述所述，完整蛋白表征可直接解析并定量生物标志物蛋白亚型，而非通过替代肽段。这在心肌肌钙蛋白I中已得到证实——其疾病相关磷酸化蛋白亚型通过自上而下MS得以解析，揭示了肽段检测无法触及的临床相关分子异质性；同样的蛋白亚型分辨范式可直接迁移至ProGRP，强化了建立蛋白水平参考测量程序的依据。

溯源性与IDMS：从精密度迈向参考测量

ProGRP文献中重现性的提升紧密跟随日益严格的内标策略的采用。缺乏内标的早期工作流程表现出显著变异性，而结构类似物的引入部分校正了样品处理损失。稳定同位素标记（SIL）肽段的广泛应用标志着在控制关键变异源方面的重大进展，实现了对酶解效率、离子抑制及仪器变异性的补偿。然而，尽管SIL肽段大幅提升了方法内精密度，但其本身并不能建立溯源链。基于肽段的同位素稀释将定量锚定于操作性替代物，而非完整生物标志物。这一区分在考量平台间可比性与参考测量程序（RMPs）开发时变得关键。近期明确比较免疫亲和与无抗体IDMS导向工作流程的研究同时凸显了当前方法的潜力与局限：精密度优异，但与免疫测定相比仍存在系统性偏差。从计量学角度看，这种偏差不应被框定为“准确度”高低，而是反映了根本不同的测量原理——表位依赖的免疫反应性对阵序列定义的分子定量。准确度只能相对于约定的参考系统进行断言；在缺乏高阶参考物质与约定被测量的情况下，此类准确度声称仍是暂时性的。从基于肽段的IDMS迈向蛋白水平IDMS（由同位素标记的完整ProGRP标准品支持），是建立可追溯RMPs、实现跨MS平台乃至跨技术结果协调的合理下一步。

互通性与实施：分析卓越与现实的交汇

互通性是参考物质的一种属性，即不同测量程序对该物质的结果关系与对真实患者样本的观测关系等价。缺乏互通性可能引入程序依赖性偏差并损害校准传递，即使单个测量程序表现出可接受的分析性能。即便是分析与计量学上完善的方法，若无法以互通且操作现实的方式实施，也难以产生临床影响。ProGRP案例正是这种张力的体现。尽管通过亲和富集（无论抗体基或合成基）在灵敏度上取得了令人印象深刻的增益，但向常规临床实验室的转化仍受限。材料重现性、成本、标准化试剂盒可用性及与高通量工作流程的兼容性等因素持续制约着采纳。合成受体（包括分子印迹聚合物）为提升稳健性与可扩展性提供了有前景的路径。其化学稳定性、抗降解能力及高度可重现的生产潜力，可缓解生物抗体相关的若干局限（包括批间变异与长期试剂不稳定性）。这些特性使合成亲和试剂成为未来计量学受控MS工作流程的有力候选。自动化、在线富集及微型化系统的并行进展进一步减少了手动操作时间与操作者依赖性变异。然而，通量仍受限于酶解与孵育步骤，这使得MS在短期内更现实地定位为确证性或专科诊断工具，而非免疫测定的普适筛查替代。至关重要的是，互通性不能仅靠自动化实现。预分析变量——样品处理时间、温度、冻融循环、表面吸附及蛋白亚型稳定性——对基于MS的读数具有决定性影响。若无标准化的预分析标准操作规程（SOP）与共享的稳定性数据，即便是高度受控的分析工作流程仍是方法定义的。因此，互通性必须被视为从样品采集到结果报告的全测量链的整合属性。最后，临床实施需要分析定义量与临床决策之间的对齐。基于MS的检测常报告低于免疫测定的ProGRP值，这与被测量定义及分析特异性的差异一致。这需要开发MS定义的临床决策限，源自基于结局的研究，而非移植自免疫测定文献。若无这种重新校准，MS的分析优势无法完全转化为临床价值。

前瞻要点

从测量科学视角审视，ProGRP不仅是一个具有挑战性的生物标志物，更是一个揭示性的模型系统。它证明灵敏度、特异性与精密度——尽管必要——仍不足以实现标准化的临床检测。剩余障碍属于计量学范畴：明确的被测量定义、至高阶参考的溯源链，以及跨平台的互通性。解决这些维度可将MS从替代分析技术转变为构建参考测量程序与溯源链的实践平台，其影响远超ProGRP本身。

结论

ProGRP定量的分析演变为质谱（MS）如何将核心挑战从分析性能逐步转向测量科学提供了清晰例证。过去二十年，基于MS的方法已从概念验证研究发展为高选择性、序列定义及异构体分辨的检测，并得到同位素稀释策略的支持。这些进展明确证实MS能够满足——且在多个方面超越——小细胞肺癌（SCLC）等临床应用对灵敏度、特异性与精密度的技术要求。与此同时，本前瞻性论述综合的证据表明，仅靠分析能力不足以实现标准化的临床检测。基于MS的方法与免疫测定间持续存在的差异不应被解读为分析不足，而应归因于根本不同的被测量，以及缺乏将常规检测关联至高阶参考的溯源链。在此背景下，MS不应仅被视为替代分析技术，而应作为构建符合国际公认计量学原则的参考测量程序（RMPs）的赋能平台。根据国际临床化学与检验医学联合会（IFCC）及检验医学溯源联合委员会（JCTLM）的标准化原则，ProGRP目前仍缺乏全面标准化所需的必备要素。明确定义的被测量、互通性参考物质，以及支持跨平台溯源的经验证RMPs仍属空白。基于肽段的同位素稀释质谱是该发展轨迹中的关键中间步骤，提供了稳健的内校正并改善了方法内精密度。然而，此类方法本质上仍属操作性，无法单独建立至完整生物标志物的溯源链。因此，向蛋白水平同位素稀释质谱（IDMS）迈进——由同位素标记的完整ProGRP蛋白亚型支持——代表了开发适于国际认可的高阶参考系统的有前景的未来方向。同样关键的是认识到互通性不能被视作次要的分析考量。预分析变量——包括样品处理、温度、冻融循环、吸附效应及蛋白亚型稳定性——对基于MS的读数具有决定性影响。若无标准化的预分析标准操作规程与共享的稳定性数据，即便是经过严格验证的分析工作流程也无法确保实验室间的结果可传递性，从而削弱IFCC认可的参考体系的根本基础。综合来看，现有证据支持一套连贯的计量学路线图：明确的被测量定义、IDMS架构的战略性选择、高阶参考物质的开发、预分析条件的标准化及多实验室验证，共同汇聚于建立稳健RMPs的目标。在此框架下，与临床解读的对齐自然随之而来，使得源自参考系统的MS定义决策限成为可能，而非承袭自传统免疫测定。由此可见，基于MS的ProGRP定量不应被视为对免疫测定的颠覆性替代，而是构建标准化校准、方法间对齐及具临床解释性结果所依托的计量学支柱。虽然ProGRP是核心案例，但本文概述的概念框架广泛适用于众多受方法间分歧困扰的低丰度蛋白生物标志物。更广泛而言，它阐明了分析化学如何与实验室医学及计量学整合，推动从方法定义信号向国际可追溯的临床检测的转变。