维莫非尼耐药在携带BRAF V595E突变的犬尿路上皮癌中的蛋白质组学特征

《Journal of Proteomics》：Proteomic Signatures of Vemurafenib Resistance in Canine Urothelial Carcinoma Harboring the BRAFV595E Mutation

　　

研究人员对14只携带BRAF V₅₉₅E突变（BRAF V₅₉₅E，即BRAF基因第595位氨基酸由缬氨酸变为谷氨酸）的犬（犬类）侵袭性尿路上皮癌（InvUC）样本进行了蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。这些样本通过膀胱镜检查在维莫非尼治疗前（Pre-Vem）、治疗1个月（Vem-1-month）以及疾病进展时（Vem-PD）采集，共42个肿瘤组织。在治疗1个月后，研究人员观察到对治疗有反应的犬肿瘤中蛋白质和磷酸化位点一致被早期抑制，随后在疾病进展时反弹，这凸显了肿瘤早期抑制事件在肿瘤适应和产生耐药后被逆转。受到影响的通路包括“端粒酶组装的正调控及其向Cajal小体的定位”、“蛋白质向端粒定位的正调控”以及“蛋白质向Cajal小体定位的正调控”。此外，在蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析中均观察到一致的“Rho GTP酶（Rho GTPase）信号通路”变化，强调了该通路在耐药肿瘤中的功能再激活。总之，这些发现揭示了维莫非尼早期应答和获得性耐药的分子特征，并为未来BRAF靶向治疗研究提供了宝贵资源。

论文解读：维莫非尼耐药在犬尿路上皮癌中的蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学特征

**研究背景与问题**

癌症是全球第二大死因，预计2030年新发病例将达2100万。肿瘤异质性是导致药物应答不良的主要挑战。天然发生的犬类癌症（尤其是膀胱癌）因与人类在临床病理特征、转移模式及分子亚型上高度相似，成为极具转化价值的研究模型。犬侵袭性尿路上皮癌（InvUC）中超过80%携带BRAF V₅₉₅E突变（人类对应BRAF V₆₀₀E），该突变在人类多种癌症中常见，但在膀胱癌中仅限于最具侵袭性的病例。维莫非尼（Vemurafenib）作为一种BRAF抑制剂，在前期犬类I/II期临床试验中展现出良好抗肿瘤活性，但获得性耐药仍是临床主要问题。耐药机制涉及MAPK通路再激活、替代信号通路激活及免疫效应，但总体认知不足。本研究旨在通过蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学手段，揭示BRAF靶向治疗中肿瘤早期应答及获得性耐药的分子机制。

**研究内容与结论**

研究人员对14只患有BRAF V₅₉₅E突变InvUC的宠物犬进行维莫非尼治疗，并通过膀胱镜采集治疗前（Pre-Vem）、治疗1个月（Vem-1-month）及疾病进展时（Vem-PD）共42份肿瘤组织样本，进行全局蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。研究发现了早期肿瘤抑制事件（蛋白质和磷酸化位点下调）在耐药后被逆转的核心规律，确证了代谢重编程、端粒酶功能增强、染色体维持及Rho GTP酶信号通路再激活在获得性耐药中的关键作用。此研究首次对犬InvUC组织在维莫非尼治疗背景下的蛋白质组与磷酸化蛋白质组进行系统表征，为BRAF靶向治疗耐药机制提供了临床相关的分子资源，并验证了自然发生犬类肿瘤作为人类泌尿道上皮癌转化研究模型的价值。该论文已发表于《Journal of Proteomics》。

**主要关键技术与方法**

研究采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）结合数据依赖性采集（DDA）策略，对来自14只犬（其中9只雌性、5只雄性，中位年龄11.4岁）的42个InvUC活检样本进行分析。样本分为治疗前（Pre-Vem）、治疗1个月（Vem-1-month）和疾病进展（Vem-PD）三个时间点。通过MaxQuant软件进行蛋白质鉴定与定量，Perseus平台进行统计分析（ANOVA，p<0.05），Metascape和ShinyGO工具进行通路富集分析。磷酸化肽段富集采用PolyMac试剂盒。

**研究结果**

**Study Subjects（研究对象）**：对来自14只犬的42个肿瘤样本进行蛋白质组分析，所有犬初始均对维莫非尼有部分缓解（PR）或疾病稳定（SD），后进展为疾病进展（PD），中位无进展生存期220天。

**Vemurafenib Resistance Accompanied by Metabolic Reprogramming and Upregulation of Proteins That Regulate Cell Proliferation（维莫非尼耐药伴随代谢重编程及细胞增殖调控蛋白上调）**：在具有PR的7只犬中，通过单因素方差分析（ANOVA，p<0.05）鉴定出128个显著差异蛋白。聚类分析显示大部分蛋白在Vem-1-month下调，在Vem-PD阶段回升至治疗前水平。Reactome通路分析发现Vem-PD相比Vem-1-month上调蛋白富集于“氨基酸及其衍生物代谢”、“硒代氨基酸代谢”、“脂肪酰辅酶A生物合成”及“染色体维持”等通路。其中PCNA、RBBP7、SSRP1等蛋白在Vem-PD显著上调（p<0.05）。此外，“Rho GTP酶信号通路”在蛋白质组和磷酸化蛋白质组中均被富集，BUB3和DYNC1I2等蛋白的表达模式符合早期下调后回升趋势。Gene Ontology生物过程富集分析也揭示了“端粒酶RNA向Cajal小体定位的正调控”、“蛋白质向端粒定位的正调控”等通路，涉及CCT蛋白（CCT2、CCT3、CCT4、CCT7、CCT8）构成的TRiC复合物，提示端粒酶功能增强可能是耐药机制之一。亚细胞定位显示Vem-PD上调蛋白主要定位于细胞核、蛋白酶体、细胞骨架和细胞外空间，包括多个Cajal小体相关蛋白。

**Phosphorylation Response to Vemurafenib Treatment in InvUC（InvUC对维莫非尼治疗的磷酸化反应）**：鉴定出1093个I类磷酸化肽段（磷酸化概率≥0.75），对应500个磷酸化蛋白，其中丝氨酸占89.4%、苏氨酸9.4%、酪氨酸1.2%。在PR犬中，单因素方差分析（ANOVA，p<0.1）得到63个显著差异磷酸化位点，53个在Vem-PD相比Vem-1-month上调。通路分析显示“mRNA剪接-主要通路”和“Rho GTP酶信号通路”富集，后者包含CPD、CTNNA和TJP2等蛋白。磷酸化变化轨迹同样呈现早期下降、晚期回升的模式。CAMKK2、CDK12和PRPF4B三种激酶的磷酸化状态在Vem-PD出现显著改变。

**Protein Signatures Correlated with Initial Sensitivity to Vemurafenib Treatment（与维莫非尼初始敏感性相关的蛋白质特征）**：比较Vem-1-month时SD犬与PR犬的蛋白质组，发现154个差异蛋白（p≤0.05）。SD犬中上调蛋白主要涉及代谢通路（如“有氧呼吸与电子传递”、“类固醇代谢”、“脂肪酸代谢”），其中FASN（脂肪酸合酶）在SD犬中上调3.76倍。此外，“RHOG GTP酶循环”、“Hallmark Myc靶点”和“Hallmark MTORC1信号”通路也富集。下调蛋白主要参与磷酸化通路。

**Functional Analysis of Activated Cellular Pathways Revealed by Differential Phosphoproteomics（差异磷酸化蛋白质组揭示的活化细胞通路功能分析）**：在Vem-1-month时SD犬与PR犬的比较中，79个磷酸化位点显著变化，64个在SD犬中上调，富集于“Rho GTP酶信号通路”和“甘油磷脂生物合成”。SD犬中LSP1（淋巴细胞特异性蛋白1）的多个位点（S201、S213、S217、T199）磷酸化降低，而LMNB1、SRRM2、PLA2G4A、REEP4、JUNB等蛋白磷酸化增强。

**讨论与结论部分**

**讨论**：犬InvUC对维莫非尼的初始应答良好（缓解率38%，无进展间隔6个月），但随后出现耐药。本研究首次对犬InvUC组织进行维莫非尼治疗背景下的蛋白质组与磷酸化蛋白质组系统表征。一致观察到早期蛋白和磷酸化水平下调、后期回升的趋势，表明肿瘤早期被抑制后通过适应性改变产生耐药。关键通路包括染色体维持、mRNA剪接、Rho GTP酶信号、端粒酶组装、蛋白质降解和脂质代谢。代谢重编程（如氨基酸代谢、脂肪酸代谢）是耐药的重要机制。Rho GTP酶信号通路在蛋白质组和磷酸化组中均被验证激活，BUB3和DYNC1I2等蛋白表达模式支持染色体不稳定性参与耐药。端粒酶功能增强（通过TRiC复合物折叠TCAB1）和Cajal小体相关蛋白上调提示新的耐药机制。PML蛋白虽被频繁检出但无动态变化，可能功能失活。CDK12、CAMK2、NCAPG、PCNA、FASN等已知治疗靶点的变化进一步支持该数据集在耐药研究中的应用潜力。

**结论**：本研究旨在确定BRAF靶向维莫非尼治疗前后不同InvUC组织的全蛋白质组和磷酸化蛋白质组差异。数据揭示了代谢重编程、端粒酶功能、染色体维持以及Rho GTP酶等增殖信号通路再激活之间的复杂相互作用，导致犬InvUC对维莫非尼产生耐药。这些耐药特征在多调控层面的出现，强调了继续开发同时靶向代谢灵活性和核信号中枢的联合治疗策略的必要性。此外，Cajal小体组分和TRiC复合物蛋白的参与为理解治疗耐药引入了新维度，凸显了用于功能和机制研究以及潜在治疗干预的新候选靶点。未来研究应优先通过遗传操作和功能实验验证这些靶点，并扩展到空间和细胞类型特异性蛋白质组学或单细胞分析，以更高分辨率解析肿瘤异质性。总之，这些发现不仅丰富了BRAF抑制剂耐药的现有知识，也验证了自然发生犬类肿瘤作为研究泌尿道上皮癌治疗耐药机制的有力转化模型。