基于等位基因计数法的21三体胎儿无创产前亲权鉴定：方法与案例评估

《Legal Medicine》：Allele-counting based non-invasive prenatal paternity testing for trisomy 21 fetuses:Methodology and case-based evaluation

　　

产前染色体非整倍体胎儿的亲权鉴定对传统短串联重复序列(Short Tandem Repeat, STR)分析存在解释挑战，而基于单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)的非侵入性方法可能具有优势。本研究比较了STR与非侵入性SNP检测在两名唐氏综合征（21三体）胎儿亲权判定中的应用。研究人员收集了羊水及父母外周血样本，使用STRtyper-21G系统进行STR分型；利用定制的5180个常染色体SNP捕获面板对母体血浆细胞游离胎儿DNA进行无创产前亲权鉴定(Non-Invasive Prenatal Paternity Testing, NIPPT)，随后进行高通量测序并使用产前亲权测试分析系统(Prenatal Paternity Test Analysis System, PTAS)进行统计分析。STR图谱显示21号染色体位点D21S11和Penta D存在三等位基因模式及等位基因剂量不平衡，迫使研究人员手动排除这两个位点以计算联合亲权指数(Combined Paternity Index, CPI)，导致最终CPI分别降低2倍（案例1）和21倍（案例2），获得CPI分别为3.2×109和5.7×1010。相比之下，NIPPT产生的CPI分别为2.40×10183和7.18×10154，累积排除概率(Cumulative Probability of Exclusion, CPE) >99.999999%，且无需针对非整倍体进行调整。21三体与整倍体对照之间的SNP数量及分布一致。研究结果表明，虽然STR分析受21三体妊娠染色体拷贝数变异显著干扰，但基于等位基因计数、全基因组位点冗余及累积统计模型的SNP-based NIPPT能提供稳健、客观且高度可靠的亲权证据，无需排除非整倍体位点，是胎儿染色体非整倍体背景下产前亲权鉴定的更优替代方案。

该研究发表于《Legal Medicine》。亲权鉴定在法医科学、遗传学与产前诊断领域至关重要，传统技术依赖短串联重复序列(Short Tandem Repeat, STR)分析，其为人类识别与亲缘鉴定的金标准。然而，产前亲权鉴定面临挑战，传统获取胎儿DNA需绒毛膜取样或羊膜腔穿刺等侵入性操作，伴有流产风险与心理压力。1997年Lo等人发现母体血浆中的细胞游离胎儿DNA(cell-free fetal DNA, cffDNA)推动了非侵入性产前检测(Non-Invasive Prenatal Testing, NIPT)与非侵入性产前亲权鉴定(Non-Invasive Prenatal Paternity Testing, NIPPT)的发展。尽管基于SNP的NIPPT具有安全性优势，STR因其在法医领域的地位仍被广泛使用。但在染色体非整倍体尤其是21三体(Down syndrome, DS)胎儿中，STR分析会出现三等位基因模式或峰高比异常(1:2)，干扰基于孟德尔共显性遗传的亲权指数(Paternity Index, PI)计算，需专业人员手动排除异常位点，增加复杂性并降低统计效能。目前缺乏针对DS背景下STR与NIPPT效能的直接比较研究。为此，研究人员回顾性分析两例产前确诊DS胎儿案例，分别采用羊水STR分型与母体血液cffDNA SNP分型进行亲权评估，通过对比联合亲权指数(Combined Paternity Index, CPI)与累积排除概率(Cumulative Probability of Exclusion, CPE)值，客观评价两种技术在法医准确性、操作复杂性与临床应用的价值，为染色体异常胎儿亲权鉴定提供技术选择依据。

研究人员开展了两项主要关键技术方法研究。样本来源于2025年1月至9月在湖州市妇幼保健院进行产前诊断的100名孕妇队列，从中筛选出两例STR初筛提示D21S11和Penta D位点三等位基因模式的疑似21三体病例及两例整倍体对照。关键技术一为STR分析：提取羊水细胞与外周血基因组DNA，使用STRtyper-21G荧光扩增检测试剂盒扩增20个常染色体STR位点及性别决定位点Amelogenin，在ABI 3500遗传分析仪上进行片段分离与荧光检测，使用GeneMapper ID-X软件进行等位基因判读与基因型分型，依据GB/T 37223–2018计算各位点PI及CPI。关键技术二为NIPPT：采集母体外周血分离血浆提取cffDNA，使用BGI FGID无创产前亲权测试试剂盒进行文库构建与杂交捕获目标5180个常染色体SNP，在MGISEQ-200RS平台进行双端100bp测序，使用FGID法医DNA分析与识别系统进行过滤、比对、去重、变异判读与质控，通过PTAS系统计算CPI与CPE，无需排除非整倍体位点。

研究结果如下。

3.1. STR分型揭示异常等位基因模式。研究人员对两案例羊水样本进行STR分析，严格质控确认母血污染率<1%。案例1在21号染色体D21S11位点(21q21.1)表现为双等位基因荧光峰(29/30)但峰面积比约1:1.9，存在显著剂量不平衡；Penta D位点呈清晰三等位基因峰(10/11/12)。案例2在D21S11位点呈三等位基因峰(28/29/30.2)峰比约1:1:1，P而nta D亦呈三等位基因(10/11/14)。两案例其余常染色体STR位点均严格遵循孟德尔遗传。由于D21S11和Penta D异常，软件默认二倍体模型失效，研究人员手动排除这两位点。案例1排除后CPI降低约2倍，案例2降低约21倍，剩余18个位点计算的CPI分别为3.2×10⁹和5.7×10¹⁰，虽满足国标≥10⁴但统计冗余下降。

3.2. 核型分析确诊唐氏综合征诊断。研究人员对羊水细胞培养进行染色体核型分析，两案例均为47, XY, +21核型，无非整倍体嵌合或其他结构异常，从细胞遗传学证实STR在21号染色体位点的异常源于三体拷贝数变异而非技术假象。

3.3. 非侵入性产前亲权鉴定提供亲权证据。研究人员采用基于5180个常染色体SNP的NIPPT，位点筛选符合哈迪温伯格平衡、次要等位基因频率≥0.3且连锁不平衡系数r²<0.2。案例1与案例2的CPI分别达2.40×10¹⁸³和7.18×10¹⁵⁴，CPE均>99.999999%，无需调整非整倍体。21三体组与整倍体对照组在各染色体包括21号上的SNP检出数量与分布无显著差异，21号染色体SNP捕获效率相当。SNP位点中仅约105个(约2%)位于21号染色体，其余98%分布于整倍体染色体，累积统计模型有效中和了局部非整倍体干扰，PTAS基于等位基因计数推断胎儿基因型而非剂量，不受拷贝数影响。

讨论部分总结：研究人员指出STR分析在染色体非整倍体中需主观识别并排除异常位点，降低统计力且引入实验室间差异；而NIPPT凭借位点冗余与累积计算特性，即使21号染色体存在三体导致的基因型偏差，其余数千个位点仍能维持极高CPI与CPE。PTAS系统的泊松分布胎儿分数估计量与考虑测序错误的基因型概率模型能从母体背景准确推断胎儿基因型，且基于等位计数的SNP分型本质上与染色体拷贝数无关。研究虽仅限两例21三体，但证明NIPPT在此场景下优于STR，减少人为误差并提高客观性。研究人员建议遇产前样本STR异常时先排除技术假象、确诊染色体异常，并尽可能采用NIPPT作为主要或确证方法。

结论部分翻译：总之，尽管STR分型仍是法医亲权鉴定的基石，其在涉及21三体等染色体非整倍体案例中的应用存在显著挑战。观察到的异常STR模式损害标准联合亲权指数(CPI)计算，需专家解释与人工干预。相比之下，利用母体外周血细胞游离胎儿DNA(cffDNA)的基于SNP的非侵入性产前亲权鉴定在本研究中展现出卓越的稳定性与统计效能，这归因于其固有的安全性、大量有效位点及对染色体数目异常的不敏感性。因此，对于涉及染色体异常胎儿的产前亲权鉴定，非侵入性SNP技术代表了值得在临床法医实践中推广的更优且更可靠的技术选择。随着测序成本降低与分析流程标准化，非侵入性SNP检测将在更广泛的产前法医遗传学应用中发挥日益重要的作用。