血清细胞外囊泡的蛋白质组学分析揭示Fibulin-3作为慢性乙型肝炎患者肝细胞癌的新型预测性生物标志物

《Hepatology Research》：Proteomic Analysis of Serum Extracellular Vesicles Revealed Fibulin-3 as a Novel Predictive Biomarker for Hepatocellular Carcinoma in Patients With Chronic Hepatitis B

　　

背景与目的：尽管核苷（酸）类似物（NUC）治疗降低了慢性乙型肝炎（CHB）患者的肝细胞癌（HCC）发病率，但在病毒抑制的情况下仍可能发生HCC。在NUC治疗期间识别HCC的预测性生物标志物仍具有重要的临床意义。本研究旨在通过对接受NUC治疗的CHB患者血清细胞外囊泡（EV）蛋白进行蛋白质组学分析，以识别新的生物标志物。

方法：研究人员纳入了242名接受NUC治疗超过一年、血清HBV DNA < 3.0 log IU/mL、无既往HCC且具有可用储存血清样本的CHB患者。对血清EV蛋白进行蛋白质组学分析以识别候选生物标志物，随后使用酶联免疫吸附测定（ELISA）验证其血清水平。

结果：中位年龄为55岁；144名为男性。在中位10.1年的随访期间，44名患者（18.2%）发生了HCC。研究人员识别出五种候选EV蛋白：fibulin-3、VCAM-1、fibronectin、vWF和FGFBP2。在通过ELISA测量的候选EV蛋白血清水平的单变量Cox分析中，fibulin-3和VCAM-1被识别为显著的预测因素。在多变量分析中，男性性别、GGT、AFP、fibulin-3和FIB-4指数是独立预测因子，而VCAM-1则不是。fibulin-3的截断值设定为10.8 μg/mL。在fibulin-3 ≥ 10.8 μg/mL的患者以及具有五个已识别风险因素中≥3个的患者中，HCC发病率显著更高。在具有0个风险因素的患者中，10年累积HCC发病率为0%，而具有≥3个风险因素的患者则为37.2%。

结论：血清fibulin-3是预测接受NUC治疗的CHB患者发生HCC的新型生物标志物。

**论文解读：血清Fibulin-3作为慢性乙型肝炎患者肝细胞癌的新型预测性生物标志物**

**研究背景与问题**
慢性乙型肝炎（CHB）是全球性健康问题，世界卫生组织估计2022年约有2.54亿人受其影响，约110万人死于肝硬化或肝细胞癌（HCC）。HCC是全球第六大常见癌症和第三大癌症死因，早期诊断至关重要。核苷（酸）类似物（NUC）治疗可降低CHB患者的HCC风险，但即使在乙型肝炎病毒（HBV）DNA得到抑制的患者中，HCC仍可能发生。因此，在NUC治疗期间识别预测HCC的生物标志物具有重要的临床意义。此前有研究报道了生长分化因子15（GDF15）可预测接受NUC治疗且HBV DNA被抑制的CHB患者的HCC，但其受试者工作特征曲线下面积（AUROC）仅为0.6668，显著低于FIB-4指数。为此，研究人员需要寻找新的、诊断准确性更高的标志物。细胞外囊泡（EV）由脂质双层包裹，参与细胞间通讯，在肿瘤免疫应答、细胞迁移和侵袭中发挥重要作用，且血清EV中蛋白质含量高，可检测常规全血清蛋白质组学分析难以发现的低丰度蛋白。本研究旨在通过血清EV的蛋白质组学分析识别预测HCC的候选蛋白，并通过测量其在血清中的浓度（更适用于临床实践）评估其作为预测性生物标志物的潜力。该研究首次针对接受长期NUC治疗且HBV DNA得到良好抑制的CHB患者，聚焦于血清外泌体衍生蛋白，识别出新型HCC预测性生物标志物。论文发表在《Hepatology Research》。

**主要技术方法**
研究人员采用此前报道的队列，共242名接受NUC治疗至少1年、血清HBV DNA < 3.0 log IU/mL且无既往HCC的CHB患者（中位年龄55岁，144名男性，中位随访10.1年，44例发生HCC）。使用Magcapture Exosome Isolation Kit PS基于亲和法从患者血清中分离EV。提取EV蛋白后，采用SP3方案进行蛋白质纯化，并使用胰蛋白酶和Lys-C酶解过夜。通过纳升级液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）在数据非依赖采集（DIA）模式下进行蛋白质组学分析，并使用DIA-NN软件（版本1.8）进行质谱数据分析，针对人源UniProt蛋白数据库搜索，以1%假发现率（FDR）鉴定蛋白。随后，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒测量五种候选蛋白（fibulin-3、VCAM-1、fibronectin、vWF、FGFBP2）的血清浓度，以验证其预测能力。

**研究结果**

**3.1 血清外泌体的蛋白质组学分析揭示五种候选血清标志物可预测HCC**
蛋白质组学分析从242名患者的血清EV中鉴定出1600种蛋白，其中806种蛋白在至少50%的患者中被检测到。通过单变量Cox比例风险分析，以p值<0.0001为阈值，筛选出五种候选蛋白：含EGF的纤连蛋白样细胞外基质蛋白1（fibulin-3）、纤连蛋白（fibronectin）、血管性血友病因子（vWF）、成纤维细胞生长因子结合蛋白2（FGFBP2）和血管细胞黏附分子1（VCAM-1）。通过ELISA测量了所有242名患者血清中这五种蛋白的浓度，中位数分别为10.1 μg/mL、350.9 μg/mL、23.3 μg/mL、0.88 μg/mL和1.25 μg/mL。fibulin-3、VCAM-1和vWF的血清浓度与其血清EV水平呈弱相关。

**3.2 血清Fibulin-3水平可作为HCC的预测性生物标志物**
单变量Cox分析显示，血清fibulin-3和VCAM-1水平是HCC的显著预测因素，而fibronectin、vWF和FGFBP2则不显著。多变量分析中（各变量方差膨胀因子VIF<5，无显著多重共线性），男性性别、GGT、AFP、FIB-4指数和fibulin-3水平被确定为独立预测因素，而VCAM-1则不是。根据中位血清fibulin-3浓度（10.1 μg/mL）将队列分为两组，高fibulin-3组患者年龄更大，AST、GGT和FIB-4指数更高，血小板计数和凝血酶原时间（PT）更低。fibulin-3水平与年龄、AST、白蛋白和FIB-4指数呈弱相关。

**3.3 高血清Fibulin-3水平患者发生HCC的风险增加**
预测10年HCC发生率的时间依赖性AUROC：fibulin-3为0.7205；此前报道的GDF15为0.6668（差异无统计学意义）。基于Youden指数确定fibulin-3的最佳截断值为10.8 μg/mL。按此截断值分组后，Kaplan-Meier曲线显示fibulin-3≥10.8 μg/mL的患者累积HCC发生率显著更高。研究人员识别出五个风险因素：高fibulin-3、高GGT、高AFP、高FIB-4指数和男性性别。在具有0个风险因素的患者中，10年累积HCC发生率为0%，而具有≥3个风险因素的患者为37.2%。此外，与改良PAGE-B（mPAGE-B）评分相比，fibulin-3的AUROC（0.7205）与mPAGE-B（0.7685）及联合模型（0.7876）相比，差异均无统计学意义。

**3.4 Fibulin-3即使在老年患者和轻度纤维化患者中也能预测HCC**
在49名年龄≥65岁的患者亚组中，单变量Cox分析显示FIB-4指数（包括年龄调整后的截断值）不是HCC的显著预测因素，而fibulin-3则显著预测HCC（HR=1.09，95% CI: 1.01–1.15，p=0.0289），AUROC为0.7072，整体队列为0.7205，而FIB-4指数仅为0.6216。在轻度肝纤维化（FIB-4指数<1.45）患者亚组（n=98）中，7例发生HCC，单变量分析中血清fibulin-3仍是HCC的显著预测因素，但多变量分析（包括GGT、fibulin-3和VCAM-1）因事件数有限未达到统计学显著性。

**3.5 Fibulin-3预测HCC与HBeAg状态无关**
HBeAg阳性与阴性患者的血清fibulin-3水平无显著差异（中位数9.94 vs 10.2 μg/mL，p=0.9824）。根据HBeAg状态分层的Cox分析显示，fibulin-3在HBeAg阳性和阴性队列中均为HCC的显著预测因素（阳性组：HR=1.12，95% CI: 1.07–1.19；阴性组：HR=1.09，95% CI: 1.03–1.15）。

**讨论与结论**
讨论部分指出，大多数CHB患者长期接受NUC治疗，但现有HCC预测标志物多在治疗前或治疗第一年内评估，而本研究中对治疗超过一年的患者，在任意时间点可测量的标志物更具临床价值。血清fibulin-3通过无偏倚的蛋白质组学方法识别，并通过ELISA验证，确认了其在长期NUC治疗患者中的预测价值。EV蛋白质组学分析的优势在于去除高丰度血清蛋白，富集组织泄漏蛋白和信号蛋白。在HBV感染中，EV参与病毒传播和免疫逃逸，但此前无研究报道fibulin-3在EV或血清中与CHB患者HCC的关系。Fibulin-3由EFEMP1基因编码，是一种细胞外基质（ECM）糖蛋白，调节细胞形态、增殖、黏附和运动。在HCC中，肿瘤细胞内fibulin-3表达降低与不良预后相关，而本研究显示血清高fibulin-3水平预测肝脏相关事件，包括HCC。近期研究发现fibulin-3在肝星状细胞（HSC）中表达，并随纤维化进展在肝组织中积累，调节黏着斑组装和HSC迁移。Fibulin-3可能通过调节TGF-β信号或PI3K/Akt通路参与肿瘤微环境重塑，但具体机制需进一步研究。Fibulin-3不单纯反映纤维化严重程度，在无晚期纤维化患者中也能预测HCC，补充了FIB-4指数的不足，符合HBV感染可在非肝硬化肝脏中发生HCC的病理特点。本研究存在局限性：缺乏独立外部验证队列，fibulin-3截断值为本队列的临时阈值，需外部验证；EV蛋白质组学分析的标准化方法（包括归一化）尚未统一，未来需进一步方法学标准化。结论：在接受NUC治疗超过1年且HBV DNA被抑制的CHB患者中，血清fibulin-3水平与HCC风险增加相关。