综述：建模TCR-表位识别特异性：我们应学习什么以取得成功

《Immunological Reviews》：Modeling TCR-Epitope Recognition Specificity: What We Should Learn to Succeed

　　

T细胞对感染或恶性细胞的识别是自发性和治疗性细胞免疫应答对抗病原体和癌症的核心。这种识别由T细胞受体（TCR）与表位之间的相互作用引发，表位由主要组织相容性复合体（MHC）分子上展示的抗原肽组成。TCR-表位相互作用的特征在于TCR和表位序列的高度多样性以及TCR环的高度结构灵活性。因此，破译TCR-表位识别特异性的规则并准确预测这些相互作用仍然具有挑战性。在此，研究人员综述了为预测TCR-表位识别而开发的不同策略，对主要计算框架进行分类，检查它们所依赖的数据模态，并讨论其当前局限性。然后，研究人员综合了近期研究中出现的关键概念性见解，并概述了这些经验应如何指导未来实验和下一代计算工具的设计。

**1 引言**
**1.1 T细胞表位识别**
T细胞表位识别由T细胞中表达的T细胞受体（TCR）与靶细胞（如感染细胞、癌细胞或抗原呈递细胞）表面主要组织相容性复合体（MHC）分子上展示的抗原肽之间的相互作用引发。该相互作用触发一系列分子事件，可导致细胞毒性CD8⁺T细胞杀伤靶细胞、特定CD4⁺T细胞激活CD8⁺T细胞，或CD4⁺调节性T细胞调节免疫应答。这些机制在介导和调节细胞免疫应答中发挥核心作用，如阻断免疫抑制受体的抗体、引发强T细胞免疫的疫苗以及过继转移癌症特异性T细胞在癌症免疫治疗中的临床成功所证明。

**1.2 TCR-表位三维结构**
TCR是异二聚体分子，在大多数T细胞中含有一条α链和一条β链，或在γδT细胞中含有一条γ链和一条δ链。TCR通过复杂界面结合由MHC分子展示的肽组成的表位。晶体学研究表明，TCRα和β链中的几个环（即互补决定区（CDR）1、2和3）发挥关键作用。这些环中的残基介导了与表位的大部分相互作用，尽管有证据表明这些环外的残基在某些情况下可直接接触表位。平均而言，α链和β链中与表位接触的残基数量相同。所有CDR环都具有高度结构灵活性，其精确结合模式在不同识别不同表位的TCR之间存在显著差异。这种高度灵活性，加上这些环的氨基酸组成和长度的多样性，对预测TCR-表位三维结构构成了重要挑战。然而，基于深度学习的三维蛋白结构和相互作用预测框架（如AlphaFold3（AF3））的发展正在深刻影响该领域。

**1.3 TCR序列多样性**
TCR表现出非常高的序列多样性，估计范围从10¹⁶到10⁶⁰。这种多样性源于V(D)J重组过程。首先，从TCR基因座（α链为TRA，β链为TRB）编码的V和J基因集中选择特定的V基因和J基因，以及β链的短D片段，并与每条链的恒定（C）区连接。不同V和J基因的氨基酸序列可在ImMunoGeneTics（IMGT）数据库中找到。可能的Vα-Jα-Vβ-Jβ组合数量约为10⁶。额外的多样性发生在V(D)J连接处，该区域位于CDR3环内，核苷酸插入和缺失可产生超出不同V和J基因选择所导致的可变氨基酸序列。TCR序列的极大多样性使不同T细胞能够识别许多不同的表位。CDR1和CDR2残基，以及平均80%的CDR3α和65%的CDR3β残基由V/J使用决定。其余CDR3残基来自V(D)J连接处的插入和缺失（以及TCRβ链的D使用）。CDR1和CDR2有时被称为“胚系编码”，因为其序列完全由V基因决定。然而，这种术语可能具有误导性，重要的是要强调V基因在两条链上的序列高度可变，并且不同T细胞中V基因的选择并非胚系编码。此外，大多数CDR3残基，包括现有晶体结构中直接接触表位的多个残基，以及CDR3序列的长度，都受到V和J选择的强烈影响。TCR序列通常表示为Vα+CDR3α+Jα+Vβ+CDR3β+Jβ，这对应于最紧凑的编码。或者，可以使用每条链的全长氨基酸序列。这两种编码在信息内容上是等价的，因为任何Vα+CDR3α+Jα+Vβ+CDR3β+Jβ与全长TCR序列之间存在一一对应关系。唯一例外是TRBV6-2和TRBV6-3，它们具有完全相同的核苷酸编码序列，一些方法将它们归为单个TRBV6-2/6-3基因，因为在测序水平上无法区分。少数研究，包括一些旨在建模TCR-表位识别的研究，提出使用CDR1+CDR2+CDR3序列编码TCR，有时还加上一个称为CDR2.5的额外区域。使用这种编码会导致一些信息丢失，因为不同的J片段可能产生相同的CDR3序列。然而，这种情况相对罕见，这种信息丢失不太可能对建模TCR-表位识别产生重大影响。

**1.4 表位序列多样性**
T细胞表位由展示在MHC分子上的小抗原肽组成。肽和MHC分子都表现出非常高的理论多样性。在肽方面，多样性源于MHC配体中许多氨基酸位置的特异性有限，且MHC分子可结合不同长度的肽。这导致对给定MHC结合肽的多样性估计范围为10¹⁰到10¹⁴。在MHC方面，多样性源于不同基因以及MHC基因座的高度多态性。人类MHC多样性约为10⁴。

**1.5 对特异性未确定或已知T细胞的TCR测序**
T细胞中表达的TCR序列可通过测序两个TCR基因座来确定。在批量TCR测序中，每条链使用特异性引物，TCRα和TCRβ链的库分别测序，或者一些流行方案（如ImmunoSeq）仅测序TCRβ库。这种方法具有高测序深度和中等成本，但无法恢复实际的TCRαβ对。单细胞测序方法可对每个细胞中存在的TCRα和TCRβ链进行测序，从而提供样本配对TCRαβ库的完整图像。标准商业试剂盒与有限细胞数量和高成本相关，但技术发展迅速，一些方法现在可达到非常高的细胞数量。同时，研究表明，通过结合在不同孔中分布的样本的批量TCRα+TCRβ测序以及共现TCRαβ对的计算推断，可以获得配对TCRαβ信息。TCR测序已广泛应用于特异性未确定的T细胞，以确定健康供者和患者的TCR库。TCR测序也已用于测序识别特定表位的T细胞。这些数据在理解TCR-表位识别特异性和开发预测TCR-表位识别的计算工具中发挥了关键作用。在此，研究人员综述了现有的TCR-表位识别预测方法，检查了它们所依赖的数据类型，并讨论了其主要优势和局限性。然后，研究人员概述了应采取的后续步骤以改进这些预测。研究人员关注仅使用TCR和表位序列作为输入来预测TCR-表位识别的问题，因为该场景具有最广泛的应用覆盖范围。然而，研究人员强调，正交信息（如克隆性、T细胞表型或空间位置）对于缩小生物样本中最相关抗原特异性TCR的列表非常有用。

**2 计算预测TCR-表位识别**
已经提出了几种预测TCR-表位识别的方法。它们可分为两大类：（1）直接从TCR和表位序列推断相互作用分数的方法，以下称为一维TCR-表位识别模型（1D-TRM）；（2）依赖预测的结构三维模型来推断相互作用分数的方法，以下称为三维TCR-表位识别模型（3D-TRM）。研究人员强调，这两种方法都仅使用TCR和表位序列作为输入，而有时用于3D-TRM的“基于结构”一词仅意味着这些方法使用从TCR和表位序列预测的TCR-表位复合物三维结构模型来评估两者是否相互作用。

**2.1 直接从TCR和表位序列推断相互作用分数的方法（1D-TRM）**
易于下载且结构良好的识别不同表位的TCR数据库的可用性，推动了多种工具的开发，以利用这些数据构建1D-TRM来预测TCR-表位识别。为了综述现有工具中的主导模式，研究人员对几种方法进行了调查，选择标准包括命令行实现或Web界面的可用性以及一些基本文档。可以概述两类主要的1D-TRM。首先，机器学习1D-TRM旨在将TCR（通常还有表位）序列嵌入到某个高维空间中，并学习一个可能非常复杂的函数或流形，以表征识别每个表位的TCR。然后，这些模型可以对新的TCR-表位对进行评分，以预测它们是否相互作用。其次，基于距离的1D-TRM旨在使用TCR之间的距离或相似性度量，来量化新TCR与已知与给定表位相互作用的TCR的相似程度，并基于此相似性预测与该表位的相互作用。机器学习工具和基于距离的方法在计算上对于注释大的TCR库都很高效，可以在标准台式计算机上每分钟对几千到一百万个TCR进行评分。

**2.1.1 机器学习方法**
这些是最广泛使用的预测TCR-表位相互作用的方法，近年来已提出了近50种不同的机器学习1D-TRM。有些直接使用TCR序列并学习一个潜在空间，在其中构建分类器，而另一些则依赖蛋白质语言模型。在预测范围和所考虑的特征方面出现了一些模式。例如，绝大多数工具原则上可以针对任何表位进行预测。这些被称为泛表位工具。许多描述此类工具的研究声称对未见表位（即没有已知TCR的表位）具有泛化能力。然而，这些声明在最近的基准测试中未得到证实。其他工具为每个表位提供单独的模型，被称为表位特异性工具。一些工具结合了泛表位和表位特异性架构。用于训练这些工具的数据主要来自三个数据库：VDJdb、IEDB和McPAS。使用这些数据训练1D-TRM的不同研究包括不同级别的数据整理（见下文讨论）。尽管机器学习1D-TRM数量众多，但只有其中五个（即TEMPO、MixTCRpred、ERGO-II、EPIC-TRACE和pMTnet-omni）提供了考虑完整TCR和完整表位序列（即Vα+CDR3α+Jα+Vβ+CDR3β+Jβ和肽+MHC）的预训练模型。少数其他方法不考虑MHC。虽然这可能导致一些混淆，因为相同肽在不同MHC上呈递时可被非常不同的TCR识别，但原始MHC等位基因在大多数情况下可以相对容易地检索。大多数其他工具专注于CDR3序列，其中许多仅考虑CDR3β序列，并经常滥用地将其称为“TCR序列”。这可能代表一个重要限制，因为α链中编码的特异性以及Vβ使用中编码的大部分特异性无法从CDR3β序列推断出来。

**2.1.2 基于距离的方法**
这些方法依赖TCR之间的相似性或距离度量，通过计算TCR与已知结合该表位的TCR的距离来推断TCR是否结合给定表位。其中一些方法，如TCRdist，使用通用的生物学/结构知识来定义距离。其他方法使用通用的蛋白质语言模型（如ESM-2或ProtBert），或专门为TCR训练的模型。许多这些工具依赖最近邻原则来预测表位限制，通常需要用户提供一组注释了其同源表位的TCR，作为距离计算的参考。最近的独立基准测试表明，不同的距离定义，包括基本指标如CDR编辑距离，会导致相似的预测准确度。一些方法考虑两条链的完整TCR序列或CDR环，而其他方法则专注于子部分（例如，GLIPH2的CDR3α+CDR3β+Vβ+Jβ或TCRMatch的仅CDR3β）。所有这些方法都属于表位特异性类别，因为它们只能对具有已知TCR的表位进行预测。一些提供注释的表位特异性TCR参考数据集，而其他方法则要求用户在使用工具进行TCR-表位相互作用预测时提供参考数据。由于它们不试图学习需要大量训练数据的复杂函数，因此可以应用于已知TCR较少的表位，尽管对于已知TCR较多的表位，预测准确度更高。基于距离的方法可能对数据中的污染物敏感，并且大多数方法不学习TCR序列的哪些部分对给定表位编码更多或更少的特异性。

**2.2 依赖结构建模的方法（3D-TRM）**
另一类模型旨在利用预测的TCR-表位复合物结构模型中的信息。历史上，这类方法取得的成功有限，主要是因为除了与实验TCR-pMHC晶体结构高度同源的情况外，获得可靠的TCR-肽-MHC（pMHC）三维复合物模型面临挑战。然而，基于深度学习的蛋白质结构预测方法（包括AlphaFold2（AF2）、其继任者AlphaFold3（AF3）及相关架构）的出现，显著提高了TCR-pMHC界面的建模准确性，即使在没有密切相关结构模板的情况下也能进行信息性相互作用分析。尽管如此，在许多情况下，由于链间共进化信号弱、CDR环高度灵活以及实验解析的TCR-pMHC复合物三维结构有限，准确解析TCR-pMHC结合几何形状仍然具有挑战性。已经提出了几种策略来提高性能，包括使用自定义结构模板、定制多序列比对以及在TCR-pMHC特定数据集上进行模型微调。除了改进结构预测本身，还开发了多种策略来从预测的TCR-pMHC复合物中提取相互作用相关信号。这些方法大致可分为三种范式。首先，一些方法依赖结构预测器提供的内在置信度指标（如界面预测模板建模（ipTM）或预测对齐误差（PAE））作为相互作用可能性的代理，例如TCRBridge或TCRDock。其次，自定义结构描述符或界面评分函数将预测的坐标转换为类似能量或基于接触的分数，如TCRen或NetTCR-struct。第三，多模态深度学习框架将结构衍生的嵌入与序列信息相结合，直接学习相互作用模式，如DeepAir、STAG-LLM。每种范式代表了可解释性、泛化能力和对几何不确定性鲁棒性之间的不同权衡。虽然该领域尚未完全成熟，但许多早期报告提供了明确证据，表明对于某些表位取得了非常成功的预测，包括TCR结合到与已知TCR的表位无序列相似性的未见表位的情况。这得到了IMMREP25竞赛结果的证实，在该竞赛中，分离了结合公共数据库中没有已知TCR的表位的TCR，任务是预测哪些TCR结合哪些表位。与先前的基准测试一致，所有1D-TRM都失败了，而使用TCR-表位复合物三维模型评分相互作用的方法在某些表位上观察到了一些预测能力。因此，预计这类方法将对TCR-表位识别预测产生重要影响。截至目前，一个重要的挑战是知道何时可以信任3D-TRM的预测以及何时失败，以及原因。3D-TRM的另一个限制与计算效率有关。通常，建模和评分一个TCR-表位复合物可能需要几十秒到几分钟，这使得对数千名患者队列中数十万个TCR的库进行数十个表位的评分具有挑战性。

**3 阳性数据的挑战**
所有1D-TRM都依赖训练数据，形式为相互作用的TCR-表位对，用于拟合机器学习预测器中的评分函数或计算距离。与许多其他领域一样，训练数据的质量和深度在预测准确性中起着核心作用。此外，所有1D-和3D-TRM都依赖此类数据进行基准测试。对于TCR-表位相互作用，根据研究人员最新内部编制的现有数据库和近期研究，79个表位有丰富的（即≥50个TCR，双链）数据可用。这些数据对于理解TCR-表位识别特异性的关键原理（包括不同表位中V/J基因、CDR3长度和CDR3序列基序的特定富集）至关重要。除此之外，大约一百多个表位有一些数据（10-49个TCR），一千多个表位有非常有限的数据（1-9个TCR），而在传染病、癌症或自身免疫中，成千上万的其他可能、通常未知或特征不佳的表位没有训练数据。这种表位空间的非常有限的覆盖范围解释了为什么1D-TRM未能外推到未见表位。近期研究强调了现有数据质量的重要问题。下面讨论在表位特异性TCR数据集中可以找到的一些主要问题。然而，研究人员强调，许多研究不受这些问题的影响，并提供可靠的数据，可用于训练或基准测试TCR-表位相互作用预测器。

**3.1 表位特异性T细胞的分离**
实验鉴定结合特定表位的TCR通常依赖于分离识别表位的T细胞并对其TCR进行测序。最常见的是，通过流式细胞术，使用pMHC多聚体或识别T细胞活化表面标志物（如CD137）的抗体分选T细胞。然后可以使用引言中讨论的TCR测序流程确定这些T细胞中的TCR。在这些实验中可能出现几个问题。

**3.1.1 实验设计和阴性对照的问题**
尽管流式细胞术是一项成熟技术，但在分离表位特异性T细胞时，需要仔细的阴性对照以最小化假阳性的风险。根据研究的不同，可能并非始终进行此类对照，这可能导致T细胞被报告为识别特定表位，而实际上对应于背景噪声。门控策略的问题也可能出现，有时难以追溯。这些风险在旨在收集识别多个表位的大型TCR数据集的大规模研究中尤其重要，因为验证每个表位分析中使用的所有参数可能很困难。

**3.1.2 pMHC多聚体的问题**
pMHC多聚体的构建需要专业技能，并且对于某些类别的MHC分子（如MHC-II）具有挑战性。理论上，应始终使用已知的表位特异性TCR验证pMHC多聚体。当处理研究充分的表位时，这种验证是可能的。然而，当考虑新表位时，阳性对照更难建立。很可能一些报告的表位特异性TCR无法在后续研究中得到验证，原因是初始研究中使用的pMHC多聚体存在问题。为了提高基于pMHC多聚体的表位特异性T细胞注释的通量，研究设计了DNA条形码多聚体，可用于染色异质性T细胞群体。然后可以应用单细胞TCR/条形码测序来推断相互作用的TCR和表位对。这种方法的一个挑战来自DNA条形码泄漏。例如，在10X Genomics提供的一个大型数据集中，许多细胞中观察到多个条形码，导致大量假阳性，如多项研究所报告。

**3.1.3 活化标志物表达的问题**
使用pMHC多聚体分选的替代方法包括用特定肽刺激分离的外周血单核细胞，并根据活化标志物（如CD137）的（过）表达分选T细胞。这种方法具有对所有表位使用相同抗体组的优点。然而，这里也可能出现一些问题。首先，无法100%确定刺激中使用的肽实际展示在哪个MHC等位基因上。如果用于刺激的细胞携带的MHC分子在其结合基序上有一些相似性，此问题尤其相关。其次，不能排除用于刺激的肽的较短版本实际上出现在某些MHC上，因为这些肽在抗原加工过程中可能被切割。当使用呈递在MHC-I分子上的10聚体或更长肽时，此问题尤其相关，因为这些肽的较短版本有时可以结合相同或其他MHC。最后，非特异性激活虽然相对罕见，但不能排除。除了实验中的质量控制，研究人员强烈鼓励研究人员始终可视化任何新生成的表位特异性TCR数据集，以检测潜在污染的迹象。为此，研究人员小组最近开发的TCR特异性谱框架提供了一种标准化方法来无缝探索表位特异性TCR的库。该框架能够与识别相同表位的其他TCR数据集进行快速比较（如果此类数据可用）。它还可以揭示缺乏特异性，其特征是V/J基因使用和CDR3长度分布遵循基线TCR库的分布。此类情况通常与数据中大量假阳性相关。

**3.2 TCR测序与TCR重建**
**3.2.1 TCR测序的问题**
所有TCR测序方案都容易出错。这些错误可能发生在PCR扩增过程中或测序本身。PCR错误与许多TCR测序方案相关，这些方案利用多轮PCR扩增来更好地检测来自TCR基因座的读段。当今仪器的测序错误很少见，但测序的高读段数使得此类错误仍有可能发生。PCR和测序错误可导致CDR3序列出现错误的氨基酸，或给V/J基因重建带来挑战。缓解这些问题的策略利用独特分子标识符，并已开发出统计模型来去除许多假序列。

**3.2.2 TCR重建的问题**
在对TCR进行测序时，读段仅捕获TCR序列的子部分，通常包括完整的CDR3+相邻核苷酸，有时还包括V片段的其他子部分。然后通过从测序读段推断V和J基因来确定实际的全长TCR序列。一些V基因表现出高序列相似性，这可能导致歧义。这些包括例如TRBV6-2和TRBV6-3，它们具有完全相同的核苷酸序列，或TRBV12-3和TRBV12-4，其最后199个核苷酸序列相同。从TCR测序数据重建TCR时，此类情况可能难以或不可能区分（在TRBV6-2和TRBV6-3的情况下）。在其他情况下，在推断V和J片段时出现了其他类型的错误，尤其是在较旧的数据集中。可以通过检查CDR3序列与V/J基因之间的兼容性来检测其中一些问题，尽管由于许多V基因（如人类大多数Vβ基因中的CASS基序）CDR3部分的相似性，这种方法无法找到所有可能的问题。

**3.3 数据处理与提交**
**3.3.1 TCR序列的问题**
在数据库中提交的TCR序列中观察到了许多问题。一个常见问题来自CDR3的不同定义。通常，大多数研究使用CDR3的定义，从保守的半胱氨酸（C）开始，在人类中大多数J基因以保守的苯丙氨酸（F）结束，TRAJ33、TRAJ38和TRAJ55以色氨酸（W）结束，或TRAJ35以半胱氨酸（C）结束。然而，其他研究省略了第一个和最后一个氨基酸。不幸的是，即使在同一个研究中，有时也使用了不同的CDR3定义。其他问题涉及V和J基因命名。这是因为不同研究使用了不同的命名惯例。例如，TRAV1-2基因（IMGT命名）有时被称为TCRAV1-2、hTRAV1-2、TRAV01-2、TRAV01-02、Va1-2或TRA1-2。此外，一些研究包括等位基因信息（TRAV1-2*01），而其他研究仅报告基因水平注释（TRAV1-2）。虽然已经设计了方法来协调数据集，但完全协调仍然具有挑战性，因为一些差异相当反直觉。例如，Adaptive Biotechnologies使用的基因命名中的TCRBV12-1实际上对应于IMGT命名中的TRBV12-3，但IMGT中存在TRBV12-1，尽管编码假基因。类似地，Adaptive Biotech中的TCRBV7-1是IMGT中的TRBV7-6。研究人员提倡使用IMGT数据库中定义的命名，该命名在现有研究和数据库中使用最广泛，并且已经精心维护了几十年。AIRR社区提供的指南也非常有助于改善跨数据集的标准。由于数据处理不当，可能会出现其他类型的错误。例如，在McPAS数据库中，研究人员小组最近报告说，几个V和J基因名称的第二位数字被省略了。这些不同的问题可能促成了许多研究在建模TCR-表位识别特异性时忽略V和J基因，而仅考虑CDR3序列的决定，尽管CDR3外的残基在表位识别中起核心作用。

**3.3.2 肽序列的问题**
肽序列的不准确也可能发生。首先，如前所述，在某些情况下，用于刺激的肽被切割，一些报告识别初始肽的TCR实际上识别了该肽的较短版本。在其他情况下，构建上传数据到数据库的文件时会发生手动错误。例如，在一项研究中，使用了Melan-A表位（ELAGIGILTV，限制为HLA-A*02:01），但TCR在VDJdb中作为结合ELAGIGLTV（即LTV前的第二个I缺失）输入。许多研究还使用肽序列的前三个字母（例如，ELAGIGILTV的ELA）。虽然这使人类大脑更容易记忆，并且在大多数情况下可以明确识别研究中使用的不同肽，但在整合来自多个研究的数据时可能会产生问题。

**3.3.3 MHC序列的问题**
MHC等位基因也遇到几个问题。首先，许多研究不报告MHC。当无法明确确定MHC限制时，例如在使用肽刺激后基于活化标志物表达进行分选时，可能发生这种情况。不幸的是，即使已知MHC，一些研究也仅提供肽序列。对于常见表位，通常可以猜测MHC限制，但并非总是如此。MHC等位基因的不同命名也出现问题。例如，在表位特异性TCR数据库的不同研究中，经过充分研究的HLA-A*02:01等位基因以A*02:01、A0201、A2、HLA-A*02、HLA-A2、HLA-A*0201、HLA-A*02:01:110、HLA-A*02:01:48、HLA-A*02:256或HLA-A*02:266出现。类似歧义也经常发生在小鼠MHC等位基因中。例如，H2-Kb、H-2KB或H-2Kb都指相同的小鼠MHC。这些问题可能难以纠正，并可能促成了许多研究在建模TCR-表位识别时忽略MHC的决定，尽管TCR和MHC残基之间的相互作用在表位识别中起核心作用。

最近一项研究通过实验证明，对于几个具有许多报告TCR的表位，存在相当大比例的假阳性。此类错误对TCR-表位识别预测的影响取决于应用。当使用此类数据对1D-TRM或3D-TRM进行基准测试时，假阳性可能会降低特定工具的预测能力，即使是高度准确的方法也可能仅产生适度的受试者工作特征曲线下面积（AUC）值。当使用此类数据训练1D-TRM时，影响将取决于污染的数量和类型。一些有限且相对随机的污染不太可能对机器学习1D-TRM产生太大影响，因为大多数可以容忍训练数据中的一些假阳性。基于距离的1D-TRM可能对此类污染物更敏感。广泛的随机污染可能对1D-TRM产生重大影响，通常导致预测在TCR空间中表现出有限特异性，并且在顶部预测中有大量假阳性。最后，表现出强烈偏倚的污染，例如对另一个表位的特异性，可能会显著偏倚模型。

**3.4 阴性数据的挑战**
大多数TCR-表位识别预测方法需要一些关于阴性数据的信息，即不结合表位的TCR。例如，大多数机器学习1D-TRM要么在训练数据中显式使用阴性数据，要么隐式假设阳性数据中不存在的TCR-表位组合不结合。基于距离的1D-TRM通常依赖阴性数据来定义距离或相似性度量的合理阈值。1D-TRM或3D-TRM的基准数据集也需要非结合TCR-表位对来计算AUC等性能指标。在TCR-表位识别的情况下，已知的实验验证阴性数据很少。此外，这些数据通常存在偏倚，包括例如CDR3环或表位序列中的点突变，并不反映非结合TCR-表位对的全部多样性。因此，大多数研究使用了人工生成的阴性数据，并提出了不同的方法。

一种可能的方法，称为“随机阴性”，是从特异性未确定的TCR库中随机选择TCR。这种方法模拟了现实场景，其中需要从患者或健康供者的TCR库中预测表位特异性TCR。假阴性的风险很小，因为只有极小部分特异性未确定的TCR库中的TCR结合给定表位。当在训练和测试数据中使用相同或相关研究的阴性数据时，如果这些研究显示出与用于生成阳性数据的研究相比重要的批次效应或偏倚，则可能出现一个重要问题。这些偏倚通常影响V/J使用，进而导致CDR3序列的不同长度和氨基酸组成。如果是这种情况，任何机器学习算法都有很高的风险学习这些模式，这可能导致人为膨胀的预测准确度，甚至在未见表位上表现出预测能力。

另一种方法，已在许多研究中使用，通常称为“交换阴性”，包括将一些报告结合其他表位的TCR作为阴性数据。这种方法的主要动机是解决之前提到的阳性与阴性之间批次效应或偏倚的风险。与随机阴性一样，假阴性的可能性有限，通常不会对预测产生太大影响。然而，交换阴性方法出现了其他问题。首先，这种场景不反映TCR-表位相互作用预测的现实应用，因为很少遇到注释仅由识别来自混合来源（如常见病毒和癌症表位）的几十个预定且研究充分的表位的TCR组成的库的任务。其次，如果不同表位特异性的TCR来自不同研究，批次效应或偏倚可能仍然存在，当考虑用于训练大多数现有工具的大量表位特异性TCR集合时，通常就是这种情况。第三，由于用于推导阴性的一些表位具有许多已知TCR，例如A0201_GILGFVFTL，阴性数据中经常出现显著的特异性模式。第四，这种方法在阴性数据中创建了强烈的聚类结构。机器学习算法有很高的风险学习这些潜在的批次效应、特异性模式或阴性数据中的聚类结构。这可能导致显著膨胀的预测准确度，包括对未见表位的预测能力。提出的缓解方法包括使用10%假阳性率下的部分AUC而不是标准AUC，这降低了通过“学习阴性”获得膨胀AUC的风险，但不能完全阻止。

由于交换阴性不反映TCR-表位识别预测的现实应用，研究人员提倡不要使用它们对现有工具进行基准测试，而应使用来自TCR库的TCR。在这种情况下，用作阴性的TCR理想情况下应来自与阳性相同的同一研究和同一供者。如果这在实践中不可行，则应在训练和测试数据中使用不同的研究来收集阴性数据，并应努力确保这些研究不共享相似的批次效应。根据研究人员的经验，TCR特异性谱框架是快速探索不同研究之间潜在偏倚的便捷工具。如果仍然选择交换阴性策略，研究人员强烈建议确保训练和测试集中的阴性数据不来自相同的表位，以便1D-TRM无法学习训练和测试数据之间共享的阴性特异性或聚类模式。

除了阴性数据存在偏倚的风险外，重要的是要认识到，即使1D-TRM训练数据中的阴性数据相比阳性数据大量过剩，也只能覆盖TCR库全部理论多样性的极小部分。正如研究人员在最近工作中提出的，依赖在数亿个TCR序列上训练的基线TCR库概率模型来建模阴性的方法，代表了一种有前途的替代方案，克服了在训练1D-TRM时显式提供阴性数据所固有的局限性。

**4 建模TCR-表位识别特异性——为什么TCR和表位序列空间的大小很重要**
TCR和表位序列的巨大理论多样性对如何建模TCR-表位识别特异性有着深远影响。

在TCR方面，TCR序列的高理论多样性（>10¹⁶）和TCR-表位识别中观察到的高特异性表明，只有极少数现有TCR可以识别给定表位。这意味着，在来自患者的现实库中，TCR与识别特定表位的TCR在其序列上表现出强相似性但不结合该表位的可能性实际上非常小。这些情况包括交换的α-β对，尽管具有看似好的α链和β链，但不结合表位。此外，这种非结合TCR不太可能在体内被选择和经历克隆扩增，因为大多数不会结合患者中存在的任何表位。

α链和β链的多样性及其在表位识别中的基本作用进一步表明，在预测TCR-表位识别时，理想情况下应考虑完整TCR序列（即Vα+Jα+CDR3α+Vβ+Jβ+CDR3β）的信息。这是因为，对于大多数表位，与表位结合兼容的链更有可能与阻止表位结合的互补链配对，而不是与保持表位结合的互补链配对。此原则的例外包括识别主要共享表位的TCR，或在特定T细胞亚型（如黏膜相关不变T（MAIT）细胞）中表达的TCR。另一个重要考虑因素出现在对仅考虑单链TCR的方法进行基准测试时。由于此类基准测试中使用实验验证的配对TCRαβ序列，因此大多数被视为阳性的单链TCR与兼容识别相同表位的互补链配对。然而，如上所述，在实际库中情况并非如此。这可能导致在评估仅考虑一条链的方法时敏感性膨胀，因为如果与未预定的良好互补链配对，大多数阳性实际上不会结合。换句话说，在当前基准测试中用作阳性的单链TCR，在实际TCR库中由于其可能与非结合且高度多样化的互补链配对，因此更有可能作为非结合物出现。

表位空间的大小和多样性也对建模TCR-表位识别产生重要后果。为了说明这一点，首先考虑所有结合特定MHC等位基因的抗原肽。此类肽可以来自数百种高度多样化的病原体、肿瘤相关抗原或癌症特异性非同义改变，甚至来自自身免疫性疾病中的自身蛋白。因此，其中大多数除了由MHC结合施加的相似性外，不共享任何同源性。自然界中发现的大多数抗原肽之间除了由相似MHC限制和氨基酸基线频率施加的相似性外，普遍缺乏相似性，表明这些肽均匀地覆盖潜在MHC配体空间，不能分组为少数几个簇或“表位超型”。这表明大多数自然存在的表位不会共享相似的TCR识别规则。该假设已在实验数据中得到广泛证实，其中观察到识别不同肽（限制为相同MHC）的TCR之间相似性有限。唯一的例外包括一些表现出非常高序列相似性的肽。这些情况可以包括不同病毒株中观察到的密切相关变体或人工序列修饰。与近期研究一致，这一观察结果