抑制纤毛发生通过AKT信号通路缓解牙龈衰老中的细胞衰老

《Aging Cell》：Suppression of Ciliogenesis Alleviates Cellular Senescence via AKT Signaling in Gingival Aging

　　

衰老，作为一种内在风险因素，加速牙龈炎症和牙周疾病的发生。然而，牙龈衰老的细胞和分子机制仍不清楚，阻碍了靶向治疗的发展。在这项研究中，研究人员首次对衰老人类牙龈进行了单细胞转录组分析（scRNA-seq），确定初级纤毛（primary cilia）是牙龈成纤维细胞衰老的潜在调节因子。研究人员证明，与年轻组织相比，衰老牙龈组织表现出成纤维细胞衰老增加和纤毛发生增强。抑制纤毛发生显著降低了衰老标志物，并缓解了衰老成纤维细胞中的DNA损伤，同时伴随AKT活化增加。此外，在衰老牙龈成纤维细胞中抑制纤毛发生后，发现FOXO1失活和DNA修复相关基因表达增强。重要的是，抑制AKT部分逆转了由纤毛发生抑制诱导的抗衰老表型。在功能上，腺相关病毒（AAV）介导的衰老小鼠纤毛发生抑制减轻了牙龈成纤维细胞衰老、减少了炎症并减轻了组织纤维化。这些发现强调初级纤毛可能参与调控牙龈成纤维细胞衰老，并将纤毛动力学和纤毛下游的AKT信号确定为管理衰老相关牙龈疾病的潜在治疗靶点，为改善老年人牙周健康提供了一种潜在策略。

**抑制纤毛发生通过AKT信号通路缓解牙龈衰老中的细胞衰老：一项单细胞转录组与功能研究解读**

**研究背景与问题**

衰老是多种慢性疾病的重要风险因素，尤其在牙周疾病中，超过60%的65岁以上老年人患有不同程度的牙龈炎症和组织退化。牙龈作为牙周组织的第一道防线，其免疫微环境失调会显著增加牙周炎的易感性。然而，牙龈衰老的细胞和分子机制尚不明确，制约了靶向治疗策略的开发。既往研究虽提示巨噬细胞和成纤维细胞在牙周衰老中发生细胞衰老，但具体调控机制，特别是初级纤毛这一细胞“天线”在牙龈成纤维细胞衰老中的作用，仍属空白。因此，阐明牙龈衰老的分子基础，尤其是成纤维细胞衰老的驱动因素，对于开发抗衰老疗法、改善老年人牙周健康至关重要。

**研究概述与结论**

研究人员首次对健康人牙龈组织（年轻组20–25岁，老年组>65岁）进行单细胞转录组测序（scRNA-seq），发现牙龈成纤维细胞中衰老相关基因表达显著上升，且纤毛组装相关基因表达增强。结合体外原代培养的牙龈成纤维细胞（摘自18–75岁健康供体）和体内老年小鼠模型（22月龄C57BL/6J小鼠），研究人员通过基因敲低（shRNA靶向IFT88和KIF3A）和药物抑制（Ciliobrevin D）纤毛发生，证实抑制纤毛发生可显著缓解牙龈成纤维细胞衰老，机制上依赖于AKT信号通路的激活及其下游FOXO1的失活和DNA修复能力增强。该研究揭示了初级纤毛在牙龈衰老中的新角色，并提出纤毛动力学和AKT信号作为管理衰老相关牙龈疾病的潜在治疗靶点，为改善老年人口腔健康提供了新策略。论文发表在《Aging Cell》。

**主要关键技术方法**

研究人员使用了以下主要技术方法：1）单细胞转录组测序（scRNA-seq），样本来源于健康人牙龈组织（年轻组2例，老年组3例，每例为多名相似供体牙龈组织混合）；2）体外原代培养牙龈成纤维细胞（GFs），供体年龄范围18–75岁；3）基于慢病毒载体的shRNA敲低技术，靶向纤毛发生必需基因IFT88和KIF3A；4）腺相关病毒（AAV）介导的局部基因敲低，用于22月龄老年小鼠上颌牙龈的体内实验；5）药理学抑制纤毛发生（Ciliobrevin D，一种动力蛋白ATP酶抑制剂）；6）免疫荧光染色、Western blot、SA-β-gal染色、流式细胞周期分析、qRT-PCR及bulk RNA-seq等分子与细胞生物学技术。

**研究结果**

**2.1 衰老人类牙龈组织呈现细胞衰老和慢性炎症特征**
通过组织学染色（H&E、Masson）和免疫荧光（IF）分析，研究人员发现老年牙龈固有层中成纤维细胞数量减少，纤维化增加，p16阳性细胞增多，IL-6和CD45阳性免疫细胞浸润增加，Ki67阳性细胞减少，表明衰老人类牙龈中细胞衰老和炎症反应增强。

**2.2 scRNA-Seq揭示衰老牙龈成纤维细胞中纤毛相关基因表达变异**
对年轻和老年牙龈组织进行scRNA-seq分析，结合UMAP降维和细胞类型鉴定，发现成纤维细胞在老年组中SenMayo衰老评分升高最显著。基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，衰老成纤维细胞中细胞投影组织（包括纤毛组装）相关基因上调，纤毛结构基因（如IFT20、IFT122、TUBA1A等）和纤毛发生调控基因（如ARF4、Rab5a等）表达显著增加。

**2.3 衰老人类牙龈成纤维细胞表现出显著细胞衰老**
体外培养的老年来源GFs中，SA-β-gal阳性率从18.95%升至59.48%，p53、p21、p16、IGFBP3蛋白水平升高，γ-H2AX荧光强度增强，G0/G1期细胞比例增加1.45倍，确认了衰老成纤维细胞的衰老特征。

**2.4 抑制纤毛发生逆转牙龈成纤维细胞衰老**
免疫荧光染色显示，老年牙龈组织中纤毛发生频率和纤毛长度均增加。在老年GFs中敲低IFT88或KIF3A后，SA-β-gal阳性率从59.76%降至23.14%和17.86%，p53、p21、p16、IGFBP3蛋白水平降低，γ-H2AX强度减弱，G0/G1期细胞比例下降，SASP因子（IL-6、IL-1β、TGF-β）mRNA水平降低，表明抑制纤毛发生可缓解衰老表型。

**2.5 敲低IFT88通过激活AKT信号通路逆转牙龈成纤维细胞衰老**
bulk RNA-seq分析显示，shIFT88处理的老年GFs中PI3K–AKT通路富集，磷酸化AKT（p-AKT）水平升高。使用PI3K抑制剂LY294002或AKT1/2抑制剂VIII处理可部分逆转shIFT88诱导的抗衰老表型，包括恢复p53、p21、p16表达，增加SA-β-gal阳性率和γ-H2AX强度。此外，纤毛发生抑制后FOXO1磷酸化增加，其下游靶基因GADD45表达下降，DNA修复相关基因（XRCC5、BRCA1、RAD51）表达上升，且这些变化可被AKT抑制剂部分逆转。

**2.6 通过AAV-Sh-IFT88抑制纤毛发生减轻小鼠牙龈衰老和牙周炎症**
在22月龄老年小鼠上颌牙龈局部注射AAV-sh-IFT88后，牙龈成纤维细胞纤毛发生率从5.80%降至1.00%，p16阳性细胞减少72.24%，Ki67阳性细胞增加，IL-6和CD45水平降低，胶原纤维含量减少34.33%，同时牙釉质-牙骨质界到牙槽骨嵴（CEJ–ABC）距离增加（提示骨丧失减轻），表明抑制纤毛发生可缓解牙龈衰老、炎症和纤维化。

**讨论与结论**

讨论部分指出，该研究基于单细胞转录组数据首次揭示了纤毛相关机制在牙龈成纤维细胞衰老中的作用，并证实AKT信号作为纤毛动力学的下游效应器。与以往认为上皮细胞驱动牙龈衰老的观点不同，本研究强调成纤维细胞衰老是牙周功能障碍的关键致病因素。研究还发现，衰老细胞中纤毛过度稳定可能最初是应激适应反应，但持续稳定会维持和强化衰老状态。然而，纤毛-衰老相互作用具有组织依赖性，在阿尔茨海默病等模型中纤毛发生减少，提示需谨慎考虑治疗策略。此外，AKT定位在纤毛基体，抑制纤毛可增加AKT磷酸化，而FOXO1失活和DNA修复增强是下游效应。研究局限性包括：尚不清楚驱动纤毛过度稳定的因素、纤毛与AKT的直接分子互作未完全阐明、动物实验样本量小、单细胞池样本可能掩盖个体异质性、IFT88和KIF3A可能具有非纤毛功能、AAV局部注射可能存在溢出效应等。未来需实现精确、组织特异性的纤毛动力学调控以用于口腔治疗。

**研究结论**：
总之，本研究提供了对牙龈衰老与初级纤毛之间关系的全面理解。它强调了衰老背后的新机制，并提出了针对纤毛的组织特异性策略来对抗衰老相关牙周疾病，最终旨在改善老年人的牙周健康。