肠道分节丝状细菌通过调节T细胞功能抑制B16F10皮下肿瘤生长

《Mucosal Immunology》：Gut segmented filamentous Bacteria impedes growth of B16F10 subcutaneous tumors via modulating T cell function

　　

肠道微生物群组成影响先天性免疫和适应性免疫，且这种影响既存在于肠道内，也存在于肠道外。其中一个突出的肠外实例是分节丝状细菌（segmented filamentous bacteria，SFB）；其在肠道中的定植可重编程肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages，AM），并在全身水平塑造T细胞极化。研究人员据此假设，SFB的这些作用将影响抗肿瘤免疫。研究人员通过静脉和皮下注射B16F10细胞对该假设进行了检验，这两种方式分别模拟小鼠转移性肺癌和黑色素瘤。SFB定植并不影响模型肺癌，但可抑制黑色素瘤生长，并同时延长生存期。这种保护作用在Rag1缺陷小鼠中完全消失，表明SFB介导的肿瘤抑制需要适应性免疫参与。同时，SFB促进CD4⁺和CD8⁺ T细胞浸润肿瘤，并进一步增强其活化。SFB定植所提供的肿瘤抑制水平与免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade，ICB）相近，但两者具有叠加效应。因此，微生物群组成以位点特异性方式影响T细胞介导的抗肿瘤免疫。对这类相互作用机制的理解，可能为癌症预防和治疗提供依据。

该研究发表于《Mucosal Immunology》，围绕肠道分节丝状细菌（segmented filamentous bacteria，SFB）是否能够影响肠外部位抗肿瘤免疫这一问题展开。既往研究表明，肠道微生物群可深刻塑造宿主免疫系统，不仅调节肠道局部免疫稳态，也可影响皮肤、脑、肺和心脏等远隔器官。在肿瘤领域，越来越多证据提示，肠道微生物群能够改变多种肿瘤类型的抗肿瘤免疫，并影响免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade，ICB）等治疗方式的疗效。现有认识多强调微生物群通过作用于先天免疫细胞，进而影响T细胞，从而调节肿瘤免疫反应。SFB是其中极具代表性的单一菌种，在小鼠中可紧密附着于回肠上皮，强力诱导Th17细胞分化，并可在全身范围塑造T细胞极性。与此同时，SFB还可在T细胞之外影响先天免疫，例如诱导肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages，AM）发生表观遗传重塑。尽管SFB对宿主防御的影响已被广泛认识，但其是否影响肠外抗肿瘤免疫，特别是是否以不同组织部位为依赖背景而发挥不同作用，仍缺乏直接证据。因此，开展本研究具有重要必要性：一方面可厘清特定共生菌与抗肿瘤免疫之间的因果关系，另一方面有助于理解微生物群调控癌症结局的部位特异性机制。

研究人员采用B16F10黑色素瘤细胞构建两类经典小鼠模型：静脉注射形成实验性肺转移模型，皮下注射形成局部黑色素瘤模型。研究结果显示，SFB定植并未改变肺部B16F10转移灶负荷，也未改变由SFB⁺或SFB^?供体来源AM移植后受体小鼠的肺部肿瘤负荷，提示即使SFB能够显著重塑肺驻留先天免疫细胞，其对肺部该模型中的肿瘤防御并无可检测影响。与之形成鲜明对比的是，在皮下肿瘤模型中，SFB定植显著减缓肿瘤生长、降低终末肿瘤重量，并延长荷瘤小鼠生存期。这一差异说明，SFB对抗肿瘤免疫的调控并非普遍增强，而是具有明确的位点特异性。

进一步机制研究表明，SFB对皮下肿瘤的抑制依赖适应性免疫。Rag1^?/?小鼠缺乏成熟淋巴细胞，在该背景下，SFB虽可正常甚至略高水平定植，但其抑制皮下肿瘤生长和改善生存的作用完全消失。这一结果直接说明，SFB介导的肿瘤抑制不能由先天免疫单独完成，而需要适应性免疫参与。研究人员进一步进行T细胞回输实验，将SFB⁺或SFB^?荷瘤野生型小鼠脾脏来源T细胞转移至Rag1^?/?小鼠。结果显示，接受SFB⁺供体T细胞的小鼠肿瘤生长有下降趋势，虽然统计学支持有限，但结合后续肿瘤浸润淋巴细胞分析，整体上支持T细胞是SFB发挥抗肿瘤作用的关键效应群体。

在肿瘤浸润T细胞层面，研究人员发现SFB显著增加皮下肿瘤内CD4⁺和CD8⁺ T细胞浸润水平，并增强其效应功能。流式细胞术显示，SFB⁺小鼠肿瘤内CD4⁺ T细胞中IFNγ⁺和TNFα⁺细胞的频率及绝对数均升高；CD8⁺ T细胞则表现出更强的IFNγ和TNFα产生能力，并伴有颗粒酶B（Granzyme B）表达升高，提示其细胞毒性功能增强。值得注意的是，研究并未在皮下肿瘤内检测到Th17细胞，说明SFB虽是经典Th17诱导菌，但在本模型中的抗肿瘤效应并不表现为肿瘤局部Th17细胞积累。此外，SFB并未显著改变肿瘤内调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）比例，也未增强肿瘤内自然杀伤细胞（natural killer cells，NK cells）的效应分子产生，提示其作用具有一定细胞类型选择性，主要集中于肿瘤浸润效应T细胞而非广泛增强所有抗肿瘤免疫细胞群。

除免疫表型外，研究还考察了T细胞代谢重编程。T细胞内在代谢状态与其效应功能密切相关，尤其糖酵解增强常与细胞因子产生和细胞毒性提升相联系。研究人员从肿瘤中分选CD4⁺和CD8⁺ T细胞，利用Seahorse细胞外通量分析检测其代谢特征。结果表明，SFB⁺小鼠来源的肿瘤浸润CD4⁺和CD8⁺ T细胞均表现出更高的细胞外酸化率（extracellular acidification rate，ECAR），而氧消耗率（oxygen consumption rate，OCR）未见明显变化，提示其代谢状态偏向糖酵解。进一步糖酵解应激试验显示，这些T细胞的糖酵解水平和糖酵解能力均升高。该结果说明，SFB不仅增强肿瘤浸润T细胞数量和效应分子表达，还可重塑其代谢程序，为其在肿瘤微环境中的功能发挥提供代谢支持。

在治疗相关性方面，研究人员还评估了SFB与抗PD-L1免疫检查点阻断的关系。结果显示，SFB定植本身与抗PD-L1治疗单独应用时对B16F10皮下肿瘤的抑制程度相近，但二者联合可产生更强的肿瘤抑制效果。这表明，SFB所诱导的免疫增强效应并不与ICB重叠到完全相同的程度，而是具有可叠加性，提示微生物群干预可能成为提高ICB疗效的潜在辅助手段。

研究采用的主要关键技术方法包括：在Georgia State University建立并验证SFB阴性与SFB定植的C57BL/6及Rag1^?/?小鼠模型，利用qPCR检测粪便中SFB定植水平；通过B16F10细胞静脉注射和皮下注射分别建立肺转移与皮下黑色素瘤模型；采用肺泡巨噬细胞过继转移和脾脏T细胞过继转移评估特定免疫细胞贡献；分离肿瘤浸润淋巴细胞后以流式细胞术分析CD4⁺、CD8⁺ T细胞、Treg及NK细胞表型和效应分子表达；分选肿瘤浸润T细胞并以Seahorse细胞外通量分析评估OCR、ECAR及糖酵解能力；结合抗PD-L1给药评价SFB与ICB的联合作用。

以下结合论文结果部分各小标题进行概括。

SFB colonization does not affect lung metastasis
研究人员首先基于SFB可重塑肺泡巨噬细胞这一已知现象，检验其是否影响肺部抗肿瘤免疫。通过B16F10静脉注射肺转移模型发现，无论注射1 × 10⁵还是2 × 10⁵个肿瘤细胞，SFB⁺与SFB^?小鼠肺部肿瘤负荷均无显著差异。进一步采用AM过继转移策略，将来源于SFB⁺或SFB^?供体的AM移植至受体小鼠后，再建立肺转移模型，结果依旧未见肺部肿瘤结节数差异。由此得出，SFB及其诱导的AM表型改变不足以影响该肺部肿瘤模型进展。

SFB colonization suppresses growth of subcutaneous tumors
研究人员随后评估SFB对皮下黑色素瘤的影响。通过B16F10皮下注射模型发现，SFB定植显著减缓肿瘤体积增长，降低终末肿瘤重量，并延长荷瘤小鼠生存时间。该结果说明SFB在皮下肿瘤环境中能够发挥明确的肿瘤抑制效应。

Suppression of tumor requires adaptive immunity
为明确SFB作用是否依赖适应性免疫，研究人员在Rag1^?/?小鼠中重复皮下肿瘤实验。尽管SFB可有效定植Rag1^?/?小鼠，但其对肿瘤生长、终末肿瘤大小和生存的改善作用完全消失。进一步T细胞过继转移实验显示，来自SFB⁺供体的脾T细胞仅呈现有限度的抗肿瘤增强趋势。综合这些结果，可得出SFB介导的肿瘤抑制依赖适应性免疫，且T细胞是最可能的核心执行者。

SFB enhances effector functions of tumor-infiltrating T cells
研究人员在皮下肿瘤形成10 d后分离肿瘤浸润淋巴细胞并进行流式分析。结果显示，SFB增加肿瘤内CD4⁺与CD8⁺ T细胞浸润。CD4⁺ T细胞的IFNγ和TNFα表达增强，CD8⁺ T细胞的IFNγ、TNFα和Granzyme B表达增强，而Th17细胞未被检测到。对其他细胞群分析表明，Treg频率未显著改变，NK细胞效应分子表达亦未增强。研究人员因此认为，SFB选择性增强了肿瘤浸润效应T细胞的数量和功能。对肺转移模型中的肿瘤浸润T细胞分析虽发现若干变化，但整体幅度较小且缺乏一致功能模式，不能形成有效肿瘤控制。

SFB reprograms metabolic phenotypes of tumor-infiltrating T cells
研究人员进一步通过Seahorse分析明确SFB是否改变肿瘤浸润T细胞代谢。结果显示，SFB⁺小鼠肿瘤来源CD4⁺和CD8⁺ T细胞均表现出升高的ECAR、增强的糖酵解和更高的糖酵解能力，而OCR无明显变化。该结果支持SFB使肿瘤浸润T细胞发生代谢重编程，形成更有利于效应功能发挥的糖酵解偏向状态。

SFB enhances ICB immunotherapy
在B16F10皮下肿瘤模型中，研究人员进一步比较SFB与抗PD-L1治疗单独或联用的效果。结果显示，SFB定植和抗PD-L1单独使用均可抑制肿瘤生长，而联合处理产生更强抑瘤效应。由此可见，SFB对抗肿瘤免疫的促进作用可与ICB叠加，具有潜在转化意义。

讨论部分主要围绕三方面展开。其一，研究确认SFB对抗肿瘤免疫的影响具有位点特异性：能够抑制皮下肿瘤，却不影响肺转移瘤。其二，T细胞是SFB发挥肿瘤抑制作用的关键。尽管脾T细胞回输实验支持力度有限，但Rag1^?/?实验结果以及肿瘤浸润T细胞增强这一证据链共同支撑该判断。其三，研究提示SFB可能通过增强肿瘤浸润T细胞的效应功能和糖酵解代谢状态来强化抗肿瘤反应，同时与ICB具有叠加潜力。作者亦指出，SFB为何不能抑制肺部B16F10肿瘤仍未完全阐明；肺部肿瘤微环境可能对先天效应细胞依赖更强，而SFB未增强NK细胞功能，且其诱导的AM改变未转化为可检测的肺部抗肿瘤效应。总体而言，该研究为“特定共生菌可通过T细胞介导并以组织部位为依赖方式调控抗肿瘤免疫”提供了直接证据。

研究结论部分可译为：总之，本研究报道SFB定植以位点特异性的、T细胞介导的方式增强了抗肿瘤免疫。更深入地理解SFB增强T细胞抗肿瘤功能的机制，可能有助于深化对抗肿瘤免疫的认识，并/或推动癌症免疫治疗策略的改进。