四硫代钼酸铵通过铜依赖的LOX信号减轻骨癌痛和肿瘤相关破骨细胞活化

《Neurobiology of Pain》：Tetrathiomolybdate reduces bone cancer pain and tumor-associated osteoclast activation through copper-dependent LOX signaling.

　　

骨癌痛（BCP）影响大多数骨转移患者，且目前的镇痛药物疗效不佳。本研究评估了四硫代钼酸铵（TTM），一种临床用铜螯合剂，其同时靶向BCP中破骨细胞活化和铜依赖性肿瘤生长的潜力。研究人员使用股骨内注射Lewis肺癌细胞的小鼠模型，TTM（20–40 mg·kg^?1每日）显著减轻了机械性异常性疼痛和热痛觉过敏，即使在疼痛建立后开始治疗也是如此。TTM抑制了骨组织和骨髓来源巨噬细胞培养物中的破骨细胞分化标志物。它还直接抑制了体外肿瘤细胞活力，并将体内肿瘤负荷减少了43%。机制上，TTM下调了肿瘤骨中的赖氨酰氧化酶（LOX），外源性LOX部分逆转了TTM对破骨细胞分化的抑制作用。这些发现表明，TTM可能通过抑制铜依赖性肿瘤进展和减弱LOX相关的破骨细胞活化来缓解BCP。研究人员的这些结果支持进一步研究铜依赖性信号通路作为肿瘤相关骨破坏和癌性疼痛的潜在调节因子。

骨癌痛（bone cancer pain, BCP）是骨转移患者最常见的并发症之一，约65–75%的患者受累，但目前镇痛药物对超过40%的患者效果不佳，现有疗法仅针对单一环节，未能解决肿瘤生长与骨破坏之间的“恶性循环”。铜稳态失调在肿瘤进展中起关键作用，铜依赖性酶如赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase, LOX）同时参与肿瘤微环境重塑和破骨细胞活化，提示铜螯合可能同步干预BCP中的多个病理过程。四硫代钼酸铵（tetrathiomolybdate, TTM）是一种已在Wilson病中临床应用的铜螯合剂，具有良好安全性，并在肿瘤模型中显示抗肿瘤活性，但其对BCP中肿瘤-骨相互作用及疼痛信号的影响尚不清楚。研究人员假设TTM可通过抑制铜依赖性肿瘤生长和破骨细胞活化缓解BCP，并涉及LOX相关信号。论文发表在《Neurobiology of Pain》。

研究人员开展的研究包括：在C57BL/6小鼠股骨内注射Lewis lung carcinoma（LLC）细胞建立BCP模型，采用早期（第1–21天）和晚期（第10–21天）两种给药方案评估TTM（20或40 mg·kg^?1每日，腹腔注射）的镇痛效果；通过von Frey纤维测定机械性异常性疼痛和撤足潜伏期；使用CCK-8法检测TTM对LLC、RAW264.7和NIH3T3细胞活力的影响；通过体内生物发光成像评估肿瘤负荷；通过qRT-PCR和组织学染色（TRAP、H&E）分析破骨细胞标志物和骨破坏；通过ELISA和qRT-PCR检测LOX表达；并在体外BMMs（骨髓来源巨噬细胞）培养中验证TTM对破骨细胞分化的铜依赖性抑制及LOX的逆转作用。主要技术方法包括：BCP模型建立（股骨内注射LLC细胞，小鼠来源为上海必凯实验动物有限公司）、行为学评估（von Frey纤维）、CCK-8细胞活力检测、生物发光成像（IVIS Spectrum）、qRT-PCR、TRAP及H&E组织学分析、铜浓度测定（试剂盒）、ELISA及c-Fos免疫组化。

研究结果如下：

**3.1 TTM dose-dependently alleviates bone cancer pain through copper chelation**
通过早期和晚期干预协议，TTM剂量依赖性地减轻了机械性异常性疼痛并延长了撤足潜伏期，晚期治疗在疼痛建立后仍能快速逆转疼痛行为。TTM（40 mg·kg^?1）使血清和骨髓铜水平恢复正常，证实镇痛作用通过铜螯合介导。

**3.2 TTM inhibits LLC cell proliferation and reduces tumor burden**
体外CCK-8实验显示TTM浓度依赖性抑制LLC细胞活力（IC₅₀ = 21.11 μM），但对RAW264.7巨噬细胞和NIH3T3成纤维细胞无影响，体现选择性细胞毒性。体内生物发光成像显示早期和晚期TTM治疗均显著降低肿瘤负荷（早期P<0.001，晚期P<0.0001），H&E染色证实骨破坏减轻。

**3.3 TTM suppresses osteoclast differentiation through copper depletion**
早期和晚期TTM治疗均显著减少BCP小鼠股骨中TRAP阳性破骨细胞数量，并通过qRT-PCR下调破骨细胞特异性标志物（RANK、TRAP、CTSK、NFATc1、OSCAR）的mRNA表达。

**3.4 TTM suppresses BMMs osteoclastogenesis via direct copper chelation**
在体外BMMs培养中，TTM（1 μg·mL^?1）抑制TRAP阳性多核细胞形成，而添加CuCl₂（10 μM）逆转该抑制效应，qRT-PCR证实铜补充恢复了TTM抑制的破骨细胞标志物表达，表明TTM的抗破骨作用依赖铜螯合。

**3.5 TTM inhibits osteoclastogenesis in association with reduced LOX expression**
TTM治疗降低了BCP小鼠股骨中LOX的蛋白和mRNA水平。体外实验中，重组LOX（100 ng·mL^?1）促进BMMs破骨细胞分化并部分逆转TTM的抑制效应，提示LOX参与TTM的调节机制。

**3.6 TTM produces rapid analgesic effects after a single administration in BCP mice**
在肿瘤形成后第14天单次给予TTM，1小时后即出现镇痛效应，2小时达峰，持续至6小时，而肿瘤大小无明显变化。脊髓背角c-Fos免疫染色显示TTM减少伤害性神经元激活，表明镇痛作用独立于肿瘤负荷减少。

讨论部分总结：TTM通过铜螯合同时抑制肿瘤生长和LOX介导的破骨细胞活化，靶向BCP的“恶性循环”，具有多机制优势。其临床安全性为快速转化提供基础，但长期铜耗竭风险需监测。研究局限性包括仅使用单一肿瘤细胞系、21天治疗期较短，以及LOX与伤害性信号之间的因果联系尚未直接建立。

研究结论部分翻译：总之，本研究提示TTM通过降低铜可用性、抑制肿瘤生长和抑制LOX相关破骨细胞活化，至少部分缓解了小鼠BCP模型中的疼痛相关行为。这些发现将铜代谢确定为肿瘤进展、破骨细胞介导的骨破坏和疼痛敏化之间的潜在联系。然而，需要进一步使用其他肿瘤模型、雌性小鼠、LOX特异性干预、阳性治疗对照和长期安全性评估来验证铜螯合对BCP的治疗潜力。