基于调控 p53 乙酰化水平视角对 p53:Sirt1 相互作用的再审视

《Communications Chemistry》：Revisiting the p53:Sirt1 interaction in light of controlling p53 acetylation levels

　　

NAD⁺依赖性去乙酰化酶沉默信息调节因子1（sirtuin 1，Sirt1）已知可通过去乙酰化调控肿瘤抑制因子 p53，但全长 p53 与 Sirt1 之间蛋白质-蛋白质相互作用的结构基础迄今仍不明确。研究人员采用整合策略，将结构质谱（structural mass spectrometry，MS）与数据驱动分子对接相结合，研究人源 p53 与 Sirt1 的相互作用。结果发现，Sirt1 仅与乙酰化 p53 结合，并形成 1:1 化学计量比复合物，而这一特征不受 p53 寡聚状态影响。研究进一步鉴定出 p53 第382位赖氨酸残基（K382）为优势乙酰化位点，并显示该位点发生选择性的 Sirt1 依赖性去乙酰化。交联质谱（cross-linking mass spectrometry，XL-MS）为 p53 与 Sirt1 之间提供了有价值的距离约束。具体而言，在 p53-K382 / Sirt1-K427 以及 p53-K120 / Sirt1-K622 之间形成的交联提示其相互作用界面具有高度柔性。基于交联施加的距离约束开展分子对接后，Sirt1 被定位于 p53 的 DNA 结合结构域和四聚化结构域附近。这为额外 Sirt1 分子与 p53 结合受到空间位阻排斥提供了依据。该研究提出了首个全长 p53:Sirt1（1:1）复合物的结构模型，并建立了一个将 p53 活性与其受 Sirt1 控制的乙酰化状态联系起来的机制框架。

该研究发表于《Communications Chemistry》，聚焦于肿瘤抑制因子 p53 与 NAD⁺依赖性去乙酰化酶 Sirt1 之间相互作用的结构与机制基础。p53 是调控细胞周期阻滞、DNA 修复、凋亡和细胞衰老的关键转录因子，同时也是一种具有大范围内在无序区（intrinsically disordered regions，IDRs）的内在无序蛋白（intrinsically disordered protein，IDP）。其功能多样性受到多种翻译后修饰（post-translational modifications，PTMs）调控，其中乙酰化尤为关键。既往研究已知组蛋白乙酰转移酶 p300 等可介导 p53 特定位点乙酰化，而 Sirt1 则可逆转这一修饰并调节 p53 的稳定性、DNA 结合特异性和转录活性。然而，围绕“全长 p53 如何以何种构象和化学计量方式与 Sirt1 结合”这一问题，既往研究仍缺乏直接结构证据。由于 p53 与 Sirt1 均含有较大比例的无序区，传统 X 射线晶体学与当前尺寸条件下的冷冻电镜（cryo-EM）均难以充分解析其全长复合物，因此有必要借助适合研究柔性蛋白复合物的整合结构生物学手段开展研究。

研究人员围绕乙酰化依赖的 p53:Sirt1 相互作用展开系统分析，尤其检验该相互作用是否独立于 p53 的寡聚状态。为此，研究构建并纯化了单体型 p53L344P、二聚体型 p53L344A 和四聚体型 p53wt，并通过 p300 定向酶促乙酰化获得相应 Acp53 变体，继而联合天然质谱（native MS）、交联质谱（XL-MS）以及分子对接进行分析。研究显示，非乙酰化 p53 不与 Sirt1 形成复合物，而乙酰化 p53 无论处于单体、二聚体还是四聚体状态，均仅与一个 Sirt1 分子形成稳定复合物，表现出与寡聚状态无关的 1:1 结合模式。进一步的位点分析表明，K382 是最主要的乙酰化位点，也是 Sirt1 选择性去乙酰化的核心靶点。交联信息和计算建模进一步支持 Sirt1 与 p53 的 DNA 结合结构域（DNA-binding domain，DBD）及四聚化结构域（tetramerization domain，TET）共同构成结合界面，从而解释了为何同一 p53 分子上难以同时结合多个 Sirt1 分子。

研究所用关键技术方法主要包括以下几类：其一，采用重组蛋白表达与纯化体系，在大肠杆菌中制备人源 Sirt1 及不同寡聚状态的全长 p53 变体，并通过 p300 HAT 结构域共表达或酶促方式获得乙酰化 p53；其二，利用天然质谱（native MS）在近天然条件下解析 p53、Acp53 与 Sirt1 的完整复合物组成、寡聚状态及化学计量比，并辅以碰撞诱导解离串联质谱（CID-MS/MS）验证复合物组成；其三，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量分析 p53 不同赖氨酸位点的乙酰化水平及 Sirt1 介导的时间分辨去乙酰化动力学；其四，利用化学交联-质谱（XL-MS）获取 p53 与 Sirt1 的残基间距离约束，再通过 HADDOCK 数据驱动分子对接整合 AlphaFold2 结构预测模型，建立全长 p53:Sirt1（1:1）复合物三维结构模型。本文未涉及人群样本队列，研究对象为体外重组蛋白体系。

在研究结果部分，论文首先以“Expression of p53 and Acp53 variants and Sirt1”为题，说明研究人员成功表达并纯化了不同寡聚状态的 p53 及 Sirt1，并借助天然质谱确认乙酰化 p53 在不同构象状态下具有不同程度乙酰化。Acp53L344P 主要形成带有0至3个乙酰化的单体，并伴有少量二聚体；Acp53L344A 以带7个乙酰化的二聚体为主；Acp53wt 则可观察到带6个乙酰化位点的四聚体以及其他寡聚体。研究还显示 p53wt 与 Acp53wt 均可与 DNA 反应元件结合，尤其 Acp53wt 主要以四聚体-DNA 复合物形式存在，说明乙酰化后的 p53 保持 DNA 结合能力。Sirt1 在天然质谱中以单体和二聚体形式被检测到，为后续复合物研究奠定基础。

在“The impact of p53’s acetylation and oligomeric states on p53:Sirt1 interaction”部分，研究核心发现是：Sirt1 仅与乙酰化 p53 结合，而不与非乙酰化 p53 结合。无论 p53 是单体型、二聚体型还是四聚体型，检测到的复合物均为一个 Sirt1 分子结合一个 p53 组装体，即 Acp53 单体:Acp53 二聚体:Acp53 四聚体均各自与单个 Sirt1 形成复合物。CID-MS/MS 解离后得到的产物包括 Acp53 单体以及含 1、2 或 3 个 Acp53 分子与一个 Sirt1 分子组成的亚复合物，提示这种结合并非表面非特异吸附，而是具有明确界面的有组织结合。

在“Site-specific acetylation and deacetylation of p53”部分，研究人员通过 LC-MS/MS 系统鉴定了 p300 介导的 p53 乙酰化位点。Acp53wt 中确认存在 K370、K372、K373、K381、K382 和 K386 的乙酰化。其中，K382 为最显著的单乙酰化位点，乙酰化比例最高；K381 乙酰化程度中等；K386 大多未修饰。这一位点分布与既往细胞研究结果定性一致。进一步的时间分辨去乙酰化实验表明，对三种 p53 变体而言，Sirt1 存在显著的位点选择性：K382 的单乙酰化信号随时间下降，同时未修饰 p53 信号增加，而 K381 的乙酰化变化相对较小。这表明 K382 是 Sirt1 去乙酰化的主要靶位点，也是 p53 招募 Sirt1 的关键调控开关。

在“Molecular details of p53:Sirt1 interaction”部分，研究人员采用 DSBU 交联剂进行 XL-MS 分析，并通过 SDS-PAGE 观察到仅乙酰化 p53 能与 Sirt1 形成交联复合物，这一结果与天然质谱一致。Acp53L344P、Acp53L344A 和 Acp53wt 分别与单个 Sirt1 形成对应分子量的复合物，进一步支持 1:1 化学计量特征。XL-MS 共鉴定出单体型、二聚体型和四聚体型 p53 分别具有 10、5 和 7 个独特的蛋白间交联位点。最重要的重复性交联包括 p53-K382 与 Sirt1-K427，以及 p53-K120 与 Sirt1-K622。前者在三种 p53 变体中均出现，说明 p53 C 端调控区 K382 与 Sirt1 催化结构域在催化过程中存在稳定近邻关系；后者则提示 p53 的 DNA 结合结构域也参与界面形成。所有交联至少涉及一个无序区残基，揭示该复合物界面具有显著柔性。尤其值得注意的是，乙酰化 K382 本身在乙酰化状态下无法参与胺反应交联，因此检测到 p53-K382:Sirt1-K427 交联意味着该交联很可能产生于去乙酰化刚发生之后、两蛋白仍保持空间接近之时，这与动力学数据高度一致。

在“Computational modeling to derive 3D-structural data of full-length p53:Sirt1 complex”部分，研究人员基于 XL-MS 提供的距离约束，结合 AlphaFold2 预测的 Sirt1、p53DBD 与 p53TET 结构，利用 HADDOCK 进行刚体对接建模。建模前移除了低置信度区域，并引入既往乙酰化 p53 C 端肽段与 Sirt1 复合物晶体结构中的附加约束。最终保留的 188 个水精修模型具有较高一致性，中位数主链均方根偏差（RMSD）为 3.7 ± 1.3 ?，支持对接结果的可靠性。模型显示，p53 的 DBD 与 TET 分别聚集在 Sirt1 的不同区域，界面以极性和带电残基介导的静电相互作用为主，且实验交联距离均得到良好满足。该模型不仅解释了 Sirt1 如何同时接触 p53 的多个结构域，也为“为何一个 p53 组装体只能稳定容纳一个 Sirt1 分子”提供了结构基础：Sirt1 占据 DBD 与 TET 联合形成的复合界面后，会对其相对空间取向施加限制，从而引发位阻排斥。

讨论部分进一步整合了上述发现。研究指出，p53 与 Sirt1 均具有大比例 IDRs，因此传统高分辨结构解析方法难以捕捉其全长复合物。借助整合结构质谱流程，本文首次从全长蛋白层面揭示了 p53:Sirt1 相互作用的化学计量、关键修饰位点和三维组织方式。综合天然质谱、位点乙酰化分析、去乙酰化动力学、XL-MS 和对接模型，研究认为：K382 乙酰化是 Sirt1 初始招募的必要前提，K120 等其他位点提供额外稳定作用；Sirt1 与 p53 的结合依赖有序结构域与无序区协同构成的动态界面；在单体、二聚体和四聚体 p53 中，Sirt1 均以 1:1 方式结合，提示其可能以顺序式方式逐个处理 p53 亚基的去乙酰化，而非多个 Sirt1 同时并行作用于同一 p53 复合体。研究同时强调，该模型为理解 p53 活性如何受乙酰化状态控制提供了机制框架，并为进一步研究柔性肿瘤抑制复合物的调控方式提供了结构基础。

研究结论部分可译为：综合来看，研究结果表明，Sirt1 仅与乙酰化形式的 p53 结合，并以表观 1:1 化学计量比与每个 p53 分子形成复合物，而这一特征独立于 p53 的寡聚状态。K382 乙酰化是 Sirt1 招募的主要决定因素，同时两种蛋白内在无序区介导的附加相互作用进一步稳定该复合物。该研究首次提供了全长 p53:Sirt1（1:1）复合物的三维结构模型，显示其界面以极性相互作用为主。整体而言，交联质谱约束和分子对接结果揭示了一种动态的 1:1 相互作用模式，其中 Sirt1 通过有序界面与无序区介导接触识别乙酰化 p53，并由此调控 p53 复合物中的连续去乙酰化循环。