《Phytomedicine Plus》：From in silico prediction to cellular validation: Discrepancies between docking affinity and biological activity of anti-inflammatory phytochemicals from Thai medicinal plants
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目的：研究人员旨在从泰国药用植物中鉴定并实验验证抗炎植物化学物质，并考察计算机模拟靶点预测、酶抑制与细胞活性之间的关系。方法：研究人员进行了一项系统综述，以识别在炎症性疾病传统治疗中有记载应用的泰国药用植物。通过分子对接模拟，针对炎症关键酶，即环氧化酶-1 (
目的：研究人员旨在从泰国药用植物中鉴定并实验验证抗炎植物化学物质，并考察计算机模拟靶点预测、酶抑制与细胞活性之间的关系。方法：研究人员进行了一项系统综述，以识别在炎症性疾病传统治疗中有记载应用的泰国药用植物。通过分子对接模拟，针对炎症关键酶，即环氧化酶-1 (COX-1)、环氧化酶-2 (COX-2)、黄嘌呤氧化酶 (XOD) 和诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)，评估所选物种中鉴定出的植物化学物质。随后对选定化合物进行的分析包括酶抑制实验、分子动力学模拟，以及利用脂多糖刺激的RAW 264.7巨噬细胞进行的细胞实验。之后进行网络药理学分析，以探索与所观察到的细胞效应相关的通路层面机制。结果：根据对接谱和靶点覆盖度，优先选择了triptocalline A (TRP) 和 daphnoretin (DAP)。尽管预测的结合亲和力良好，但两种化合物均表现出较弱的直接酶抑制活性。分子动力学模拟揭示了靶点依赖性的相互作用稳定性，但未能完全解释生化结果。相比之下，TRP在非细胞毒性浓度下通过减少一氧化氮 (NO) 产生和抑制iNOS表达，表现出显著的细胞抗炎活性，而DAP效果有限。网络药理学分析显示，TRP相关靶点富集于免疫和细胞因子相关的信号传导过程，包括与MAPK激活和白介素介导反应相关的通路，支持了通路层面调节的作用。结论：本研究表明，对于复杂的植物化学物质，对接预测的亲和力与功能性生物活性之间存在明显的脱节。研究结果强调，TRP的抗炎作用主要通过通路层面调节介导，尤其是涉及iNOS–NO轴，而非直接酶抑制。整合计算、生化、细胞和网络分析，为解释植物化学活性以及从传统药用资源中优先筛选生物活性化合物提供了更可靠的框架。
**研究背景与问题**
炎症是机体抵御损伤和感染的关键保护机制，但慢性炎症会促进类风湿关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎和痛风性关节炎等疾病的发展。当前炎症主要用非甾体抗炎药（NSAIDs）治疗，通过抑制环氧化酶（COX）来减少前列腺素合成，但长期使用存在胃肠和心血管毒性，选择性COX-2抑制剂虽提升了安全性，仍存在不良事件风险。天然产物因其多靶点和通路调节特性而备受关注，但传统药物发现周期长、命中率低。结构基的计算机模拟方法（如分子对接和分子动力学模拟）被广泛用于加速化合物筛选，但对接分数主要反映静态结合亲和力，忽略了溶剂效应、蛋白柔性、配体聚集和细胞药代动力学，导致预测亲和力与实验活性之间存在偏差。因此，本研究旨在系统评估计算机预测与生化及细胞结果之间的一致性，并以泰国药用植物中的抗炎植物化学物质为例，揭示对接亲和力与功能性生物活性之间的差异。
**研究概述与结论**
研究人员通过系统综述筛选出泰国传统用于治疗炎症的药用植物，从中整理出7329个化合物，经分子对接针对COX-1、COX-2、XOD和iNOS进行虚拟筛选，优先选择triptocalline A (TRP) 和daphnoretin (DAP) 进行实验验证。通过酶抑制实验、分子动力学模拟、巨噬细胞实验和网络药理学分析，研究人员发现：尽管对接预测的结合亲和力良好，但两种化合物的酶抑制活性很弱（IC50在毫摩尔级），而TRP在细胞水平显著抑制NO产生并下调iNOS表达（IC50 29.08 μM），DAP效果较弱。网络药理学显示TRP靶点富集于免疫与细胞因子相关通路（如MAPK3、白细胞介素信号）。这些结果表明，TRP的抗炎作用主要通过通路层面调节（尤其是iNOS-NO轴）实现，而非直接酶抑制。论文发表在《Phytomedicine Plus》。
**主要技术与方法**
研究采用了以下关键技术：① 基于PRISMA指南的系统综述，从PubMed、ScienceDirect、Google Scholar筛选泰国传统药用植物（63种，34科），并整合文献中的植物化学数据（5323个结构确认化合物）；② 分子对接（AutoDockTools，Lamarckian遗传算法）评估化合物与COX-1（1EQG）、COX-2（4M11）、iNOS（3E7G）、XOD（3BDJ）的结合自由能和抑制常数，并用已知活性抑制剂和匹配诱饵进行ROC曲线验证（AUC>0.8对于COX-1/2和XOD）；③ 100 ns分子动力学模拟（GROMACS 2023.3，CHARMM36力场），分析RMSD、RMSF、氢键占有率和最小距离评估结合稳定性；④ 酶抑制实验（COX比色试剂盒、XOD分光光度法，以酮洛芬和别嘌呤醇为参照）；⑤ 细胞实验（RAW 264.7巨噬细胞，MTT法测细胞活力，Griess法测NO，Western blot测iNOS和COX-2表达）；⑥ 网络药理学（SwissTargetPrediction预测靶点，GeneCards检索炎症相关基因，STRING构建PPI网络，Metascape进行GO、KEGG、Reactome富集分析）。所有数据库和文献来源为公开资源，无特定样本队列。
**研究结果**
- **3.1 化合物选择**：通过系统综述发现63种植物，7329个化合物，5323个结构已确认。
- **3.2 计算机模拟结合谱**：对接验证显示COX-1（AUC 0.83，富集因子EF1% 6.84）、COX-2（AUC 0.81，EF1% 9.25）、XOD（AUC 0.77，EF1% 8.6）具有良好的区分能力，iNOS区分能力较弱（AUC 0.56）。基于对接得分和靶点覆盖度，优先选择TRP和DAP，它们分别属于醌甲基三萜和双香豆素结构类型。
- **3.3 分子动力学模拟**：100 ns模拟显示DAP在COX-2和iNOS中结合更稳定（持续氢键和稳定距离），TRP在COX-1中相对稳定，但两种配体均在某些靶点出现后期最小距离增加，提示部分解离。结合稳定性与酶抑制活性不完全一致。
- **3.4 酶抑制实验**：与对接预测的微摩尔级亲和力（Ki）相反，TRP和DAP对COX-1/2和XOD的IC50均为毫摩尔级（如DAP对COX-2 IC50=1.36 mM，TRP对COX-1 IC50=0.29 mM），而参照抑制剂酮洛芬和别嘌呤醇的IC50在微摩尔级（25.55 μM和16.84 μM），表明对接亲和力不能直接预测催化抑制活性。
- **3.5 细胞抗炎活性**：MTT实验确定TRP在≤30 μM、DAP在≤50 μM时无细胞毒性。在LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞中，TRP浓度依赖性抑制NO产生（IC50 29.08 μM）并显著下调iNOS蛋白表达，而对COX-2表达无显著影响；DAP在同样条件下NO抑制效果较弱（IC50 49.90 μM），且对iNOS和COX-2表达无显著改变。
- **3.6 网络药理学分析**：TRP预测靶点与炎症相关基因交集后，PPI网络显示核心枢纽基因包括IL6、TNF、MAPK3、NOS2等，富集分析表明TRP靶点参与免疫反应、细胞因子信号（如MAPK3、白介素、IFN-γ相关通路）和炎症调节等过程。DAP靶点富集于细胞死亡、细胞外基质重塑等更广泛的过程，与经典炎症通路关联较弱。这一结果与TRP在细胞中抑制iNOS-NO轴的作用一致。
**讨论与结论**
讨论指出，对接预测与实验结果的脱节并非筛选方法的失败，而是提示这些植物化学物质可能通过非催化或通路层面机制发挥效应。TRP的强细胞活性与弱酶抑制支持了这一解释；物理化学因素（如膜通透性、细胞内积聚）可能也影响细胞活性，但未在本研究中直接测定。分子动力学模拟提供了结合稳定性信息，但未完全解释生物学活性。网络药理学分析为TRP通过MAPK、细胞因子、IFN-γ相关信号通路调节炎症基因表达提供了通路层面的解释，而DAP的活性更侧重于信号转导、凋亡等非特异性过程。结论部分翻译如下：
本研究结合计算模型与生化和细胞分析，评估了来自泰国药用植物的植物化学物质。分子对接提示了有利的配体-靶点相互作用，但酶实验显示出弱的催化抑制，强调了对接亲和力估计的局限性。这些发现表明，计算机预测与生化实验之间的差异可以为通路层面活性提供机制见解，而非仅仅指示预测失败。分子动力学模拟和巨噬细胞实验提示，观察到的抗炎活性更可能与通路层面调节有关，而非直接酶抑制。与这些观察一致，细胞实验显示triptocalline A抑制NO产生并下调iNOS表达，而daphnoretin活性有限。网络药理学分析进一步支持这些发现，揭示triptocalline A与MAPK、细胞因子和IFN-γ相关过程等相互关联的信号通路有关，这些通路参与炎症基因调控。总体而言，研究结果表明triptocalline A可能通过多靶点通路调节而非直接酶抑制发挥抗炎作用，凸显了在天然产物研究中整合计算与实验方法的重要性。
