比较转录组分析揭示转录因子PhMYB4调控太子参中环肽B（heterophyllin B）积累

《Plant Physiology and Biochemistry》：Comparative transcriptomic analysis revealed a transcription factor PhMYB4 regulating heterophyllin B accumulation in Pseudostellaria heterophylla

　　

环肽B（heterophyllin B, HB）是太子参（*Pseudostellaria heterophylla*）中一种具有显著药用价值的关键生物活性成分。然而，HB生物合成在转录水平上的调控机制尚不清楚。在此，研究人员利用两个HB积累存在差异的品种ST1和ZS2，探索了HB生物合成的调控网络。高效液相色谱（HPLC）检测表明，在膨大期（EP）和成熟期（MP），ST1块根中的HB含量均高于ZS2。比较转录组分析在两个品种的2个发育阶段中鉴定出1,753个共享的差异表达基因（DEGs），包括HB生物合成基因*PrePhHB*和58个差异表达的转录因子（TFs）。通过基因共表达及基因-代谢物相关性分析，鉴定出11个与*PrePhHB*表达和HB含量呈正相关的TFs。其中，PhMYB4被确定为一个关键调控因子，因此被选入进行深入的功能研究。*PhMYB4*过表达可增加*PrePhHB*的表达，从而上调HB生物合成。顺式作用元件分析发现*PrePhHB*启动子中含有两个MYB结合位点。通过酵母单杂交（Y1H）和双荧光素酶（dual-luciferase）实验相结合，证实了PhMYB4通过结合其启动子区域中的MYB结合元件转录激活*PrePhHB*。总体而言，结果揭示了PhMYB4在太子参中于转录水平正调控HB积累，为环肽生物合成的调控网络提供了新见解，并突出了通过基因工程提高HB产量的潜在途径。

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## 研究背景与问题

太子参（*Pseudostellaria heterophylla*）的干燥块根作为传统中药太子参（Taizishen）已使用千年，主治病后虚弱、食欲不振、疲劳和脾虚。其特有成分环肽（cyclic peptides, CPs），尤其是环肽B（heterophyllin B, HB），具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化和抗糖尿病等多种生物活性。HB属于鸟苷酸环肽（orbitides），主要积累于太子参块根的韧皮部组织中。然而，HB在太子参中的含量极低，严重限制了其开发与利用潜力。CPs的生物合成途径已部分阐明：HB由前体肽基因（如*PrePhHB*）编码的线性前体肽经寡肽酶（如PhPOP1）的酶切和环化生成。尽管环境因素（如氮和光照）会影响HB积累，不同品种间HB含量也存在显著差异，但转录因子（TFs）如何调控HB生物合成尚不明确。阐明这一调控机制对于通过遗传工程提高HB产量至关重要。

研究人员利用两个HB积累差异显著的太子参品种ST1（高含量）和ZS2（极低含量），开展比较转录组分析，筛选潜在调控因子，并通过功能验证揭示PhMYB4对HB生物合成的正调控作用。该研究成果发表于《Plant Physiology and Biochemistry》。

## 主要关键技术方法

研究人员主要采用了以下关键方法：1）高效液相色谱检测HB含量；2）通过NovaSeq X Plus平台对块根样品（ST1_EP、ZS2_EP、ST1_MP、ZS2_MP）进行RNA测序及转录组分析；3）利用DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs），结合基因共表达分析和基因-代谢物相关性分析筛选候选TFs；4）采用发根农杆菌（*Agrobacterium rhizogenes*）K599介导的发根转化系统过表达*PhMYB4*；5）通过双荧光素酶（dual-luciferase, Dual-Luc）实验和酵母单杂交（yeast one-hybrid, Y1H）实验验证PhMYB4对*PrePhHB*启动子的直接结合与转录激活。样本来源：ST1（贵州施秉）和ZS2（福建柘荣）的块根，种植于贵州中医药大学试验田。

## 研究结果

### 3.1 两个太子参品种间HB的差异积累
通过HPLC检测，在膨大期（EP）和成熟期（MP），ST1块根中的HB含量均显著高于ZS2，且两个品种自身在EP和MP之间的HB含量差异不显著。这确认了遗传因素主导品种特异性HB积累，且效应在块根膨大早期已显现。

### 3.2 与HB生物合成相关的DEGs的比较转录组分析
对4个样品进行RNA-Seq，主成分分析显示品种间差异在MP期更大。比较ZS2_EP vs ST1_EP和ZS2_MP vs ST1_MP，分别得到3,602和4,014个DEGs，两者共享1,753个DEGs。其中包含HB生物合成基因*PrePhHB*，其表达模式与HB积累一致；而另一基因*PhPOP1*未被鉴定为DEG。qRT-PCR验证了*PrePhHB*的表达趋势。从1,753个共享DEGs中鉴定出58个差异表达TFs，分属21个家族。基因共表达分析显示16个TFs与*PrePhHB*表达模式一致；基因-代谢物相关性分析进一步揭示11个TFs与*PrePhHB*表达及HB含量均呈强正相关。对*PrePhHB*启动子进行顺式元件分析，发现两个MYB结合位点和一个ABRE结合位点。结合分析结果及先前研究中*PhMYB4*在块根韧皮部高表达的发现，选择PhMYB4进行后续功能研究。

### 3.3 *PhMYB4*过表达增强发根中的HB积累
PhMYB4的ORF为963 bp，编码R2R3-MYB蛋白，系统发育显示其与拟南芥亚组13 MYB聚类。在太子参发根中过表达*PhMYB4*，获得3个阳性株系（PhMYB4-OE-1、-2、-4）。与空载体对照相比，所有OE株系的*PhMYB4*转录水平显著升高，HB积累量也显著增加，其中PhMYB4-OE-2的HB含量达0.80 mg/g 干重（DW），为对照的3.1倍。qRT-PCR检测表明，OE株系中*PrePhHB*表达显著上调，而*PhPOP1*表达无显著变化，证实PhMYB4通过上调*PrePhHB*正调控HB生物合成。

### 3.4 PhMYB4直接激活*PrePhHB*的表达
双荧光素酶实验显示，PhMYB4可显著增强*PrePhHB*启动子驱动的荧光素酶活性。酵母单杂交实验进一步证实PhMYB4能特异性结合*PrePhHB*启动子的S1元件（MYB结合位点）。综上，PhMYB4通过直接结合并激活*PrePhHB*启动子，正调控HB生物合成。

## 讨论与结论

讨论部分指出，二次代谢产物的积累受遗传和环境因素共同调控。本研究发现*PrePhHB*表达是决定HB含量的关键因素，而*PhPOP1*表达无差异，说明转录水平调控主要作用于前体肽基因。通过共表达分析与顺式元件预测结合的策略，成功鉴定出转录因子PhMYB4，并证实其通过结合*PrePhHB*启动子MYB结合位点激活转录，从而促进HB积累。部分OE株系中*PhMYB4*转录水平与HB含量不完全一致，提示可能存在翻译后修饰（如泛素化、磷酸化）影响功能蛋白丰度。此外，其他TF家族（如NAC、ERF）也可能参与HB调控，需进一步研究。

研究结论：为克服太子参中HB含量低的瓶颈，本研究利用两个HB积累存在差异的品种ST1和ZS2，通过比较转录组学确认遗传因素主导品种特异性HB积累，关键结构基因*PrePhHB*而非*PhPOP1*决定HB含量。结合基因共表达分析、基因-代谢物相关性分析及*PrePhHB*启动子顺式元件分析，筛选出MYB转录因子PhMYB4作为正调控因子；PhMYB4通过结合*PrePhHB*启动子增强其活性，从而促进HB生物合成。本研究阐明了HB积累的遗传基础及PhMYB4-*PrePhHB*调控机制，填补了知识空白，为通过代谢工程提高HB产量提供了靶点。