《Plant Physiology and Biochemistry》：PavSnRK2.2, a member of the SNF1-related protein kinase 2 family, positively regulates ABA-induced fruit ripening in sweet cherry
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蔗糖非发酵1相关蛋白激酶2（SnRK2）家族在脱落酸（ABA）信号传导中发挥核心作用。虽然SnRK2s对果实发育和成熟至关重要，但其在甜樱桃（Prunus avium L.）中的功能仍知之甚少。在本研究中，研究人员从栽培种Tieton的基因组中分析了六个Pav
蔗糖非发酵1相关蛋白激酶2（SnRK2）家族在脱落酸（ABA）信号传导中发挥核心作用。虽然SnRK2s对果实发育和成熟至关重要，但其在甜樱桃（Prunus avium L.）中的功能仍知之甚少。在本研究中，研究人员从栽培种Tieton的基因组中分析了六个PavSnRK2基因的理化性质、染色体定位、果实发育期间的表达谱以及激素响应。由于PavSnRK2.2在成熟期特异性上调且具有ABA响应性表达模式，该基因被选作进一步功能分析的对象。在甜樱桃果实中瞬时敲低PavSnRK2.2抑制了成熟，并降低了参与花青素生物合成、细胞壁降解和糖/酸代谢的基因表达。此外，在番茄中异源过表达PavSnRK2.2显著加速了果实成熟，表现为更早的转色起始、更快的软化和着色以及糖积累增加。免疫沉淀激酶实验证实PavSnRK2.2活性可被ABA激活，强调了其在ABA介导的成熟信号中的作用。研究人员的结果不仅确定了PavSnRK2.2作为甜樱桃中ABA依赖性成熟的正调控因子，还将其鉴定为育种项目中调控成熟性状的潜在靶点。
**论文解读：PavSnRK2.2在甜樱桃果实成熟中的正调控机制**
**研究背景与问题**
甜樱桃（*Prunus avium* L.）作为一种典型的非呼吸跃变型果实，其成熟过程受复杂信号网络调控，其中脱落酸（ABA）被认为是核心激素。ABA信号通路的关键组分包括ABA受体（PYR/PYL/RCARs）、2C型蛋白磷酸酶（PP2Cs）和SNF1相关蛋白激酶2（SnRK2）家族。SnRK2作为ABA信号转导的中枢，通过磷酸化下游靶标调控果实成熟相关进程，如色素积累、果实软化、糖分积累等。然而，尽管SnRK2家族在多种植物中已有研究，其在甜樱桃中的功能仍缺乏系统解析，尤其是对果实成熟关键调控因子的鉴定和功能验证尚属空白。因此，研究者开展本研究以明确甜樱桃SnRK2家族成员及其在ABA介导成熟中的作用。
**研究内容与意义**
研究人员从甜樱桃栽培种Tieton基因组中鉴定出6个PavSnRK2家族成员，通过基因结构、顺式作用元件、表达谱及激素响应分析，筛选出PavSnRK2.2作为候选关键基因。通过瞬时沉默（TRV介导）和异源过表达（番茄稳定转化）实验，证实PavSnRK2.2正调控果实成熟进程。进一步通过蛋白互作（Y2H、BiFC）和免疫沉淀激酶实验，揭示PavSnRK2.2与PavABI1相互作用，且其激酶活性可被ABA快速激活。该研究不仅阐明了PavSnRK2.2在ABA依赖性成熟中的分子机制，还为甜樱桃育种中调控成熟性状提供了潜在靶点。论文发表于《Plant Physiology and Biochemistry》。
**主要技术方法概述**
研究人员使用了以下关键技术方法：1）通过BLASTP和PfamScan从甜樱桃Tieton v2.0基因组（来源于蔷薇科基因组数据库GDR）鉴定SnRK2家族成员；2）利用MEGA7.0、MEME、PlantCARE数据库等进行系统发育、保守基序和顺式作用元件分析；3）采用RT-qPCR分析基因在果实发育5-40天内的表达谱（样本来自北京试验站）；4）通过农杆菌介导的瞬时转化（TRV系统）在甜樱桃大绿期果实中进行基因敲低；5）利用农杆菌介导的稳定转化法将PavSnRK2.2构建体转入番茄（品种‘Ailsa Craig’）获得过表达株系；6）通过亚细胞定位（GFP融合）、双分子荧光互补（BiFC）和酵母双杂交（Y2H）分析蛋白定位与互作；7）通过免疫沉淀激酶实验（使用[γ-
32P]ATP和MBP底物）检测ABA对PavSnRK2.2激酶活性的影响。
**研究结果**
3.1 PavSnRK2基因的鉴定与分类
通过BLASTP和PfamScan从甜樱桃基因组中鉴定出6个SnRK2家族成员，分别命名为PavSnRK2.1–PavSnRK2.6。理化性质分析表明，这些蛋白均为酸性亲水蛋白，分子量38.10–41.04 kDa，等电点4.73–6.14，其中PavSnRK2.3、2.4、2.5预测为稳定蛋白，其余为不稳定蛋白。
3.2 PavSnRK2s的染色体定位与共线性分析
6个PavSnRK2基因不均匀分布在5条染色体上：Chr1上分布2个，Chr5、Chr6、Chr7、Chr8上各1个。共线性分析仅发现一对同源基因（PavSnRK2.5与PavSnRK2.6），推测源于片段重复事件。
3.3 SnRK2的系统发育分析
构建包含6个物种（拟南芥、草莓、番茄、杏、桃、甜樱桃）46个SnRK2成员的系统发育树，显示PavSnRK2与桃PpSnRK2、杏PaSnRK2亲缘关系最近，且PavSnRK2.2和PavSnRK2.4聚类于强ABA响应性亚类（Subclass III），暗示其可能参与ABA介导的成熟调控。
3.4 PavSnRK2s的基因结构、保守结构域与顺式作用元件分析
基因结构显示除PavSnRK2.4外均含8个内含子。蛋白质保守域分析确认所有成员均含核心激酶活化基序（如ATP结合、磷酸基团转移、底物识别位点）。启动子区顺式作用元件分析发现几乎所有成员均含ABA、MeJA、IAA、低温及光响应元件，提示其受多种激素和环境信号调控。
3.5 PavSnRK2s在果实发育期间的转录水平
RT-qPCR检测果实5–40天（花后）的表达谱显示，所有基因表达先升后降，多数在25–30天达峰。其中PavSnRK2.2上调幅度最大（约30倍），且起始表达水平不低，提示其为成熟关键调控因子。
3.6 PavSnRK2s对ABA处理的表达响应
外源ABA（100 μM）处理后，PavSnRK2.2、2.3、2.4转录本在24–48小时下降后于96小时恢复并超过初始水平；PavSnRK2.1、2.5、2.6无显著变化，表明PavSnRK2.2对ABA呈动态响应。
3.7 PavSnRK2s的亚细胞定位分析
所有PavSnRK2-GFP融合蛋白在烟草叶片中定位于细胞核和细胞质，呈核质分布，确认其为核质蛋白。
3.8 PavSnRK2.2调控甜樱桃果实成熟
通过TRV介导瞬时沉默PavSnRK2.2（表达量降至对照的41%），果实着色延迟，花青素合成基因（PavCHS、PavF3H、PavANS、PavDFR）、细胞壁代谢基因以及糖/酸代谢基因表达显著下调，表明PavSnRK2.2通过转录水平调控多种成熟相关过程。
3.9 PavSnRK2.2促进稳定转基因番茄果实成熟
获得6个PavSnRK2.2-OE番茄株系（#1和#2用于分析）。与空载体对照相比，过表达株系从开花到转色期缩短2–3天，转色后着色加速，番茄红素和β-胡萝卜素含量显著升高，果实硬度降低26%，柠檬酸和苹果酸分别降低19%和15%，总可溶性糖、蔗糖、果糖、葡萄糖分别增加74%、98%、85%和44%，乙烯释放速率升高，证实PavSnRK2.2全面促进番茄成熟与品质提升。
3.10 PavSnRK2.2与PavABI1相互作用
BiFC和Y2H实验均证明PavSnRK2.2与PP2C磷酸酶PavABI1发生物理相互作用，确认其作为ABA信号核心组分的地位。
3.11 PavSnRK2.2显示出快速的ABA依赖性激酶激活
免疫沉淀激酶实验显示，100 μM ABA处理10分钟即可激活PavSnRK2.2对MBP的磷酸化，20分钟达峰值，60分钟仍可检测，表明ABA快速激活PavSnRK2.2的激酶活性。
**讨论与结论总结**
讨论部分指出，PavSnRK2.2作为Subclass III成员，其激酶活性被ABA激活，与ABA促进果实成熟的功能一致。研究人员认为PavSnRK2.2通过磷酸化下游转录因子间接调控成熟相关基因表达（因其无DNA结合域），未来需鉴定直接底物以阐明分子网络。此外，虽然实验证据充分，但稳定敲除甜樱桃仍需高效遗传转化工具验证。
结论部分翻译：本研究对甜樱桃cv. Tieton中的PavSnRK2家族进行了基本特征分析，并重点关注PavSnRK2.2的核心生物学功能。果实发育及ABA处理期间的转录谱表明PavSnRK2.2是果实成熟的正调控因子。甜樱桃瞬时沉默和番茄稳定过表达的联合证据证明PavSnRK2.2是成熟的正调控因子——其在相应体系中的抑制延缓成熟，而过表达加速成熟并上调成熟相关基因表达。蛋白互作实验进一步揭示了PavSnRK2.2与PavABI1的物理关联。此外，PavSnRK2.2的激酶活性可被ABA激活，确认其参与果实中ABA信号转导。研究人员的发现不仅为PavSnRK2.2在调控果实成熟中的作用提供了分子见解，也推进了对ABA信号在这一关键过程中功能的认知。
