《Journal of Medical Virology》：Hepatitis B Doubly Spliced Protein (HBDSP) Promotes Epithelial-Mesenchymal Transition, Migration, and Invasion via SP1/ETS1-Dependent YAP Activation in Hepatoma Cells
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慢性乙型肝炎病毒(HBV）感染仍是全球重大健康负担。尽管经典HBV蛋白已有深入研究，但HBV剪接变体及其编码蛋白的病理作用尚不清楚。本研究探讨由HBV 2.2 kb双剪接变体编码的乙型肝炎双剪接蛋白(HBDSP）在肝细胞癌(HCC）中的促癌潜能及其潜在机制。体
慢性乙型肝炎病毒(HBV）感染仍是全球重大健康负担。尽管经典HBV蛋白已有深入研究，但HBV剪接变体及其编码蛋白的病理作用尚不清楚。本研究探讨由HBV 2.2 kb双剪接变体编码的乙型肝炎双剪接蛋白(HBDSP）在肝细胞癌(HCC）中的促癌潜能及其潜在机制。体外功能实验表明，HBDSP在HepG2和Huh7细胞中诱导上皮-间充质转化(EMT）并增强迁移和侵袭。机制上，细胞与分子方法揭示，HBDSP增强了SP1和ETS1的核转位，从而促进其与yes相关蛋白(YAP）启动子结合并激活YAP转录。使用药理学抑制剂维替泊芬或YAP特异性siRNA抑制YAP可有效消除HBDSP诱导的恶性表型，证实YAP在此过程中的关键作用。值得注意的是，这些效应在HBV复制型HepG2.2.15细胞和HBV感染的HepG2-NTCP细胞中均得到一致验证，进一步强化了HBDSP在HBV驱动肝癌发生中的病理相关性。综上所述，研究人员鉴定HBDSP为一种新型病毒效应子，通过SP1和ETS1依赖性方式转录激活YAP，从而促进肝癌细胞EMT、迁移和侵袭。这些发现提示，HBDSP介导的YAP激活可能在HBV驱动的HCC进展中发挥作用，并可作为潜在治疗靶轴进行深入探索，尤其在剪接型HBV变体普遍存在的背景下。
**论文解读：HBDSP通过SP1/ETS1依赖的YAP激活促进肝癌细胞恶性表型**
**研究背景与问题**
慢性乙型肝炎病毒(HBV）感染是全球重大公共卫生问题，约2.54亿人受其影响，每年导致近100万死亡。虽然经典HBV蛋白（如HBx）的作用已被广泛研究，但HBV前基因组RNA(pgRNA）通过选择性剪接产生的多种变体及其编码蛋白的病理功能仍知之甚少。目前已鉴定出至少20种HBV剪接变体（sp1-sp20），其中sp7变体编码的乙型肝炎双剪接蛋白(HBDSP）是一个139氨基酸的蛋白，包含聚合酶N端、preS1区域及新型移码序列。临床研究显示，HBV剪接变体在80%以上慢性感染者中可检测到，且肝细胞癌(HCC）患者血清中剪接型HBV(spHBV）水平显著高于非HCC患者，提示其与HCC风险升高相关。然而，HBDSP在肝癌细胞迁移、侵袭及上皮-间充质转化(EMT）中的具体作用及机制尚未阐明。EMT是HCC侵袭转移的关键前提，而YAP作为Hippo通路核心效应因子，在肝癌发生早期即被激活并与恶性亚型相关。因此，研究人员开展本研究以探索HBDSP在肝癌细胞转移相关行为中的作用及其分子机制，论文发表在《Journal of Medical Virology》。
**主要关键技术与方法**
研究人员采用多种细胞模型，包括人肝癌细胞系HepG2（购自ATCC）和Huh7（购自CCTCC），以及稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞和HBV感染的HepG2-NTCP细胞（由厦门大学提供）。关键技术包括：瞬时转染（Lipofectamine 3000）、定量PCR、Western blot、免疫荧光染色、划痕愈合实验、Matrigel侵袭实验、免疫共沉淀、荧光素酶报告基因检测、染色质免疫沉淀（ChIP）、电泳迁移率变动分析（EMSA）及共聚焦显微镜。此外，还利用TCGA-LIHC和GEO数据集GSE83148进行生物信息学分析。
**研究结果**
**3.1 HBDSP诱导EMT并增强迁移和侵袭**
通过倒置荧光显微镜观察，HBDSP过表达后HepG2和Huh7细胞形态由扁平不规则变为成纤维细胞样。qPCR、Western blot和IF检测显示，上皮标志物E-钙黏蛋白下调，间充质标志物N-钙黏蛋白和波形蛋白及EMT转录因子Snail上调。划痕愈合和Matrigel侵袭实验表明，HBDSP显著增强细胞迁移和侵袭能力。
**3.2 HBDSP可能通过上调YAP及其下游基因促进EMT**
Western blot筛选EMT相关信号通路，发现HBDSP不影响Notch1、p44/42、p38、SAPK/JNK的磷酸化，但特异性上调YAP总蛋白水平而不改变其磷酸化（Ser172）。同时，上游激酶MST2和LATS1无变化，下游靶基因CYR61和CTGF表达升高。
**3.3 HBDSP通过反式激活YAP启动子-542至-259 nt区域上调YAP表达，不依赖蛋白相互作用**
Co-IP显示HBDSP与YAP无直接结合。qPCR和荧光素酶报告实验表明HBDSP通过其反式激活结构域（Leu48-Gln75）增强YAP mRNA及启动子活性。5'端缺失分析定位关键区域为-542至-259 nt，生物信息学预测该区域含SP1、ETS1、NFIC和TFAP2A的结合位点。
**3.4 HBDSP促进SP1/ETS1核转位并增强其与启动子结合**
突变分析证实SP1和ETS1结合位点对HBDSP介导的YAP启动子激活至关重要。ChIP和EMSA显示HBDSP增强SP1和ETS1与YAP启动子的体内外结合。Western blot和共聚焦显微镜示HBDSP通过其反式激活域减少SP1和ETS1胞质分布、增加核积累。
**3.5 HBDSP以YAP依赖方式诱导EMT、迁移和侵袭**
使用YAP抑制剂维替泊芬（1.5 μM）或YAP特异性siRNA后，HBDSP引起的E-钙黏蛋白下降及N-钙黏蛋白、波形蛋白、Snail、CYR61、CTGF升高均被逆转。划痕和侵袭实验证实YAP抑制显著减弱HBDSP促进的迁移和侵袭。
**3.6 HBDSP在HBV阳性条件下促进YAP依赖的EMT、迁移和侵袭**
在HepG2.2.15和HBV感染HepG2-NTCP细胞中，HBDSP过表达同样诱导EMT标志物变化并增强迁移侵袭，这些效应被YAP抑制剂或siRNA消除。
**3.7 SP1/ETS1与YAP在HCC中表达正相关，且在HBV相关肝组织中上调**
TCGA-LIHC数据分析显示YAP1和SP1在HCC组织中显著上调，ETS1-YAP1及SP1-YAP1呈正相关。GSE83148数据集中，CHB患者肝活检组织YAP1、ETS1和SP1表达均高于正常对照。
**讨论与结论**
本研究首次揭示HBDSP通过SP1/ETS1依赖方式转录激活YAP从而促进肝癌细胞EMT、迁移和侵袭。研究人员在讨论中指出，HBDSP的作用机制不同于另一种剪接蛋白HBSP（后者主要通过蛋白-蛋白相互作用），HBDSP主要通过反式激活宿主基因发挥作用。HBDSP通过其48-75位氨基酸的反式激活域促进SP1和ETS1核转位，增强它们与YAP启动子-542至-259 nt区域的结合，激活YAP转录，进而上调CTGF、CYR61及Snail，抑制E-钙黏蛋白并诱导EMT。值得注意的是，这是首次报道ETS1直接结合YAP启动子区域。虽然效应幅度相对温和（与HBx、HBSP类似），但这种渐进性调节可能反映了HBV相关肝癌发生的慢性积累特性。研究结论部分明确：HBDSP作为新型病毒效应子，通过SP1/ETS1介导的YAP转录激活，驱动肝癌细胞恶性表型，为理解HBV剪接变体的致病机制提供了新视角，并提示HBDSP-YAP轴可能成为潜在治疗靶点。
