《Poultry Science》：Optimization of genome editing strategies for targeted integration at chicken sex chromosome loci
编辑推荐：
将大片段外源基因精确靶向整合至鸡性别染色体，对于性别连锁性状操作、性别控制育种以及禽类生物反应器模型的开发具有重要意义。然而，在性别染色体基因座实现高效靶向整合仍面临技术挑战，且针对这些基因座的优化编辑策略仍然缺乏。为了改善此前鉴定的两个鸡性别染色体安全港基因
将大片段外源基因精确靶向整合至鸡性别染色体，对于性别连锁性状操作、性别控制育种以及禽类生物反应器模型的开发具有重要意义。然而，在性别染色体基因座实现高效靶向整合仍面临技术挑战，且针对这些基因座的优化编辑策略仍然缺乏。为了改善此前鉴定的两个鸡性别染色体安全港基因座EE0.6和NC_006127.4的靶向基因组编辑效率，本研究系统评估并优化了影响编辑效率的关键参数。首先，研究人员评估了不同单导向RNA(sgRNA)组合对靶向敲除效率的影响，确立了双sgRNA/Cas9架构的优势，其在EE0.6和NC_006127.4基因座分别实现了86.67%和75.00%的敲除效率。随后，研究人员引入了此前报道显示能提高编辑特异性的Cas9切口酶(Cas9n)系统，并评估了其在两个靶基因座的性能。定量分析表明，双sgRNA/Cas9靶向系统成功介导了1.1-kb SV40-mCherry报告盒的精确靶向整合，在EE0.6基因座达到100% (28/28)，在NC_006127.4基因座达到80.00% (20/25)。基于此，本研究进一步探讨了供体同源臂(HA)长度（200 bp、600 bp和1000 bp）和载体拓扑结构（环状和线性化）对靶向敲入效率的影响。结果显示，在环状供体系统中，EE0.6和NC_006127.4基因座的最佳HA长度分别为200 bp (50.4% ± 4.4%)和600 bp (30.1% ± 1.2%)。然而，当引入具有游离末端的线性化供体时，外源目标片段的敲入效率显著增强，且其HA长度偏好发生了显著逆转。EE0.6的最佳HA长度延长至600 bp (78.9% ± 1.0%)，而NC_006127.4的最佳HA长度缩短至200 bp (49.9% ± 0.4%)。综上所述，本研究建立了一种针对鸡性别染色体基因座的高效靶向整合策略。该优化系统为未来性别连锁育种和禽类生物反应器开发的应用奠定了基础。
论文解读：《Optimization of genome editing strategies for targeted integration at chicken sex chromosome loci》
研究背景与意义
在现代畜禽分子育种中，对性状关联基因座进行精确修饰已成为重要策略，而高效的位点特异性基因敲除或敲入是阐明基因功能及调控机制的先决条件。CRISPR/Cas9系统作为一种高效的基因组工程工具，利用特异性sgRNA介导的识别与Cas9核酸酶切割，实现了精确的靶向基因组修饰。尽管该技术在哺乳动物模型中取得了显著进展，但由于鸟类独特的生物学特性，特别是其卵生生殖特点导致转基因胚胎干细胞难以像哺乳动物那样轻易植入受精卵，使得CRISPR/Cas9在禽类物种中的应用仍具挑战性，基因组编辑效率及转基因家禽的生产效率相对较低。
在众多可用的基因组工程靶点中，性别染色体基因座因能够实现性别连锁转基因的稳定遗传而备受关注，这对于性别控制育种、雏鸡性别鉴定及禽类生物反应器开发具有重要应用价值。研究人员此前已将EE0.6和NC_006127.4鉴定为鸡性别染色体上具有外源基因稳定整合潜力的两个候选安全港基因座。然而，这些基因座的编辑特性在很大程度上仍未得到探索，且尚未系统优化用于靶向敲除和敲入的高效策略。因此，开展针对这些特定位点的基因组编辑优化研究，对于基础研究和家禽育种应用均具有重要意义。
主要关键技术方法
本研究采用鸡胚成纤维细胞系DF-1作为实验模型。研究人员利用CRISPOR在线平台针对EE0.6和NC_006127.4基因座设计sgRNA，并将其克隆至PX458载体中。通过比较四种商业化转染试剂，研究人员选定ViaFect作为标准化递送载体。研究构建了单载体双sgRNA/Cas9系统及携带D10A突变的Cas9切口酶(Cas9n)系统。同时，研究人员构建了含有200 bp、600 bp和1000 bp同源臂(HA)的环状同源重组(HR)供体载体，并通过HindIII酶切获得线性化供体。通过共转染实验，结合T7E1错配切割试验、TA克隆与Sanger测序、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)以及基于半定量PCR条带灰度分析的HDR效率估算等方法，系统评估了靶向整合效率。
研究结果
鸡性别染色体安全港基因座基因组编辑载体的构建与活性评估
研究人员针对EE0.6和NC_006127.4基因座分别设计了三种sgRNA，并成功构建了相应的CRISPR/Cas9切割系统及HR供体模板。验证结果表明，所有重组载体均能在DF-1细胞中有效表达Cas9蛋白，且六种sgRNA均在其对应靶位点表现出有效的DNA切割活性。其中，sgRNA1在EE0.6和NC_006127.4基因座均表现出最高的编辑效率，因此被选作后续实验的最优sgRNA。
sgRNA组合策略对基因组编辑效率的影响
为探究多重sgRNA组合是否能提高基因组编辑效率，研究人员评估了不同的sgRNA配对方案。T7E1切割试验及TA克隆测序结果显示，sgRNA组合能比单sgRNA诱导更高效的DNA双链断裂。其中，sg1+2组合产生了最高的协同编辑效率，在EE0.6和NC_006127.4基因座的突变频率分别达到86.70%和75.00%。随后，研究人员将最优sgRNA对组装至单一PX458载体中形成单载体双sgRNA系统，该系统在EE0.6和NC_006127.4基因座分别实现了86.67%和75.00%的插入/缺失(indel)频率，表现优于双质粒共转染策略。
不同Cas9切割模式对基因组编辑效率的影响
为减少双链DNA断裂引起的非特异性效应，研究人员引入了携带D10A突变的Cas9n系统。评估发现，单载体Cas9n双sgRNA系统在EE0.6基因座达到了100%的突变频率，在NC_006127.4基因座达到了80.00%的突变频率。这表明单载体Cas9n双sgRNA系统不仅提高了编辑特异性，还实现了高效的基因组编辑。
同源臂长度对敲入效率的影响
在建立最优切割系统后，研究人员探讨了同源臂长度对HDR介导敲入效率的影响。结果显示，同源臂长度对HDR效率的影响具有位点特异性。在EE0.6基因座，200 bp供体实现了最高的HDR效率（50.4% ± 4.4%）；而在NC_006127.4基因座，600 bp供体表现出最高的重组效率（30.1% ± 1.2%）。当同源臂长度增加至1000 bp时，两个基因座的HDR效率均显著下降。Sanger测序证实了外源mCherry序列在这两个基因座的精确整合。
线性化供体载体对敲入效率的影响
供体DNA的拓扑结构是影响细胞内DNA修复的重要因素。研究发现，与具有相同同源臂长度的环状供体相比，线性化供体在EE0.6和NC_006127.4基因座的一致表现出更高的敲入效率。更重要的是，供体线性化改变了两个基因座的同源臂偏好。在EE0.6基因座，最佳同源臂长度从环状系统中的200 bp转变为线性系统中的600 bp，HDR效率达到78.9% ± 1.0%；而在NC_006127.4基因座，线性供体系统则更倾向于较短的200 bp同源臂，整合效率达到49.9% ± 0.4%。
讨论与结论
讨论
本研究围绕鸡性别染色体安全港基因座EE0.6和NC_006127.4，系统优化了转染条件、sgRNA/Cas9表达策略和供体模板配置三个维度的参数。单载体表达系统通过同步Cas9与多个sgRNA的递送，改善了多重编辑性能并减少了实验变异性。双sgRNA策略能够同时诱导两个独立的双链断裂，促进中间基因组片段的结构性删除，从而绕过易导致无效修复的单位点非同源末端连接(NHEJ)途径。此外，单载体Cas9n双sgRNA系统表现出极高的突变频率，这可能归因于单载体骨架确保了时空同步性和化学计量平衡，促进了相邻基因组位点的协调靶向。
HDR是外源DNA精确靶向整合的主要途径，但其效率受到与非同源末端连接(NHEJ)途径竞争的限制。本研究表明，EE0.6基因座偏好较短的同源臂，而NC_006127.4基因座则需要较长的同源臂。线性化双链DNA因其游离末端可直接被细胞内重组复合体识别，无需质粒松弛和超螺旋解析，从而促进快速末端切除并更有效进入HDR途径。有趣的是，供体线性化逆转了两个基因座的最佳同源臂长度偏好，这强烈表明靶向整合并非由单一因素调控，而是供体构型、游离DNA末端动力学与特定基因组基因座的局部染色质环境相互作用的结果。NC_006127.4基因座位于Z染色体上，转录活性区域维持着更开放的常染色质状态；而EE0.6基因座位于高度凝聚的异染色质基质中。这种截然不同的局部染色质状态决定了其对不同供体结构的独特偏好。
结论
本研究针对鸡性别染色体安全港基因座EE0.6和NC_006127.4，建立并优化了基于CRISPR/Cas9的靶向基因组编辑系统。结果表明，单载体双sgRNA策略显著提高了基因组编辑效率，在EE0.6和NC_006127.4基因座分别实现了86.67%和75.00%的敲除效率。引入Cas9切口酶(Cas9n, D10A)系统进一步增强了编辑特异性，并在EE0.6基因座实现了100%的体外突变频率。在靶向敲入实验中，线性化供体模板表现出比传统环状质粒显著更高的同源重组效率，在EE0.6基因座最高整合效率达到78.9%。此外，研究人员发现供体拓扑结构会以位点依赖的方式影响首选同源臂长度，这表明HDR效率受供体结构和局部基因组环境的共同影响。总之，这些发现为鸡性别染色体安全港基因座提供了一种实用的基因组编辑策略，并为未来性别连锁家禽育种和禽类生物反应器开发奠定了技术基础。
