《Poultry Science》：Bamboo polyphenols protects against Escherichia coli-induced liver injury in broilers by attenuating inflammatory responses
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由禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC）引起的禽大肠杆菌病是全球高发疾病，每年给家禽业造成巨大经济损失。尽管多种植物多酚的生物活性已有详述，但竹多酚（Bamboo polyphenols，BP）对抗AP
由禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC）引起的禽大肠杆菌病是全球高发疾病，每年给家禽业造成巨大经济损失。尽管多种植物多酚的生物活性已有详述，但竹多酚（Bamboo polyphenols，BP）对抗APEC感染的潜在治疗价值仍鲜有探索。研究人员在体外与体内层面探究了BP的抗菌与抗炎效应。结果显示，在抑菌与杀菌实验中，BP于相对较低浓度下即可抑制APEC生长并杀灭APEC。肝脏组织病理学检查与细菌负荷测定表明，BP处理减少了炎性细胞浸润，并显著降低肝组织细菌负荷。此外，研究人员发现BP在体外与体内均显著下调炎性细胞因子、趋化因子及促炎标志物的mRNA表达水平，并抑制p65、p38与ERK1/2的磷酸化。另外，BP在体外抑制脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）表达。上述发现表明，BP通过抑制细菌生长、抑制核因子κB（Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）与丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路及降低ROS水平发挥抗菌与抗炎作用，这为防控畜禽细菌性疾病及应对细菌耐药性提供了新理论基础与新策略。
研究背景方面，禽大肠杆菌病由禽致病性大肠杆菌（APEC）引起，表现为局部与全身感染，全身感染如菌血症和结肠肉芽肿病伴随高发病率与死亡率。APEC主要通过呼吸道感染家禽，也可经口、鼻、泄殖腔途径入侵，在共感染或环境应激下引发全身感染，经粪口途径、气溶胶颗粒传播，污染饲料饮水是重要媒介，垂直传播亦有报道。APEC属于肠外致病性大肠杆菌（Extraintestinal pathogenic Escherichia coli，ExPEC），常见血清型O1、O2、O18、O78，其中O78全球流行占比超80%。该病导致产蛋下降与死亡率升高，目前防控依赖抗生素，但APEC对几乎所有类抗生素产生耐药，仅对碳青霉烯类、亚胺培南、链霉素相对敏感，抗生素耐药成为全球健康关切，威胁动物健康与食品安全，亟需应对耐药新策略。多酚是植物天然抗氧化剂与次级代谢产物，分黄酮类与非黄酮类，具抗炎、抗菌、抗氧化等多重生物活性，黄酮类可通过直接杀菌、协同增效、减弱毒力发挥抗菌作用，其他植物多酚也被证实可阻断毒素毒性、改善屏障、抑制NF-κB等发挥保护效应，但竹多酚对APEC致全身疾病的影响尚无研究，因此研究人员建立白羽肉鸡APEC感染炎症模型，评估竹多酚抗菌抗炎功效，探索其作为抗生素替代品应对耐药挑战的价值。论文发表于《Poultry Science》。
主要关键技术方法中，样本为20日龄雄性白羽肉鸡，随机分空白组（Mock）、BP处理组（BP）、大肠杆菌感染组（E. coli）及大肠杆菌与BP共处理组（E. coli + BP），每组10只；BP以0.4%添加于饮水预处理3天，估计日摄入400 mg/kg体重；感染组腹腔注射3.0×109CFU大肠杆菌O78，对照组注无菌生理盐水。体外菌株包括大肠杆菌O1、O78，沙门氏菌Enteritidis、Typhimurium，金黄色葡萄球菌；细胞为HD11细胞系。采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）与最小杀菌浓度（Minimum bactericidal concentration，MBC）；RT-qPCR检测肝组织与细胞炎性因子、趋化因子、促炎介质mRNA表达，以β-actin为内参，2-ΔΔCT法计算；Western blotting检测肝组织与细胞NF-κB p65、p38、ERK1/2及其磷酸化蛋白水平；CCK-8法检测细胞活力；DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平；组织病理学采用H&E染色观察肝损伤；脏器细菌负荷通过平板菌落计数定量；统计学采用单因素方差分析与Tukey事后检验，数据以均值±标准差表示，P < 0.05为差异显著。
研究结果部分，首先为体外抗菌活性，研究人员通过二倍稀释法测定BP对不同菌株的MIC与MBC，结果显示BP对大肠杆菌O78、O1的MIC为1.9531 μg/mL至3.9062 μg/mL，MBC为7.8125 μg/mL至15.625 μg/mL；对肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌MIC为1.9531 μg/mL至3.9062 μg/mL，MBC为3.9062 μg/mL至7.8125 μg/mL；对金黄色葡萄球菌MIC为0.9765 μg/mL至1.9531 μg/mL，MBC为1.9531 μg/mL至3.9062 μg/mL。生长曲线显示BP对大肠杆菌O78增殖呈浓度依赖性抑制，1×MIC及以上浓度完全抑制12小时生长，1/4×与1/2×MIC延缓生长但12小时光密度与对照相当，证实BP有效抑制大肠杆菌O78生长。
其次为BP显著降低感染肉鸡大肠杆菌负荷并预防肝脏炎症，研究人员在感染后72小时采集肝、肺、脾组织定量细菌负荷，结果显示E. coli + BP组较E. coli组三类脏器细菌负荷均显著降低。肝组织H&E染色显示E. coli组门管区广泛炎性细胞浸润，E. coli + BP组细胞结构完整无浸润，表明BP通过减少细菌定植与减轻组织炎症对肉鸡大肠杆菌感染具保护作用。
接着为BP减轻肝脏炎性细胞因子与趋化因子mRNA表达，研究人员通过RT-qPCR检测各组肝组织转录水平，E. coli组IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-18 mRNA极显著上调，BP处理较E. coli组极显著下调；趋化因子IL8L1、IL8L2、CCL4、CCL20、CXCL13、CXCL14、CX3CL1在E. coli组较Mock极显著升高，BP处理显著抑制所有趋化因子转录，表明BP在转录水平抑制促炎细胞因子与趋化因子表达以减轻肝炎症。
随后为BP抑制体外炎性细胞因子与趋化因子mRNA表达，研究人员先以CCK-8确定BP在4 μg/mL及以下对HD11细胞无毒性，选此浓度后续实验；LPS（1 μg/mL）刺激下IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18及IL8L1、IL8L2、CCL4、CCL20、CXCL13、CX3CL1 mRNA显著升高，BP预处理显著下调这些转录本，表明BP在细胞水平通过转录抑制关键炎性因子与趋化因子发挥直接抗炎效应。
再者为BP减轻体内外肝脏与细胞促炎介质mRNA表达，体内实验E. coli组肝组织iNOS、COX-2、HIF-1α、PTGES、PKM2 mRNA较Mock显著升高，BP处理显著下调；体外HD11细胞LPS刺激上调iNOS、COX-2、HIF-1α、PKM2，BP处理显著抑制，表明BP通过抑制细菌挑战下关键促炎介质转录上调发挥抗炎作用。。
然后为BP抑制体内外NF-κB与MAPK信号通路激活，研究人员通过Western blotting检测磷酸化水平，体内大肠杆菌感染使肝p65、p38、ERK1/2磷酸化显著增加，BP处理明显减弱；体外LPS刺激HD11细胞p65、p38、ERK1/2磷酸化显著，BP共处理明显减弱，表明BP通过抑制NF-κB与MAPK信号通路响应细菌感染或LPS刺激发挥抗炎活性。
最后为BP降低LPS刺激细胞胞内ROS水平，研究人员以DCFH-DA荧光检测HD11细胞，对照组荧光弱，LPS刺激荧光强度显著增加，BP处理明显减弱LPS诱导荧光，表明BP有效抑制活化HD11细胞ROS生成，通过降低LPS诱导ROS产生发挥抗氧化作用从而贡献抗炎效应。
讨论部分总结，研究人员指出大肠杆菌普遍存在于禽肠道，致病株致全身感染即大肠杆菌病，限抗政策下多酚因抗氧化、抗菌、抗炎受关注，中国竹资源丰富，竹多酚具可持续大规模应用潜力。本研究MIC与MBC显示BP对革兰氏阳性与阴性菌均具抑制杀菌效，与红酒多酚提取物一致，生长曲线呈浓度依赖抑制，多酚可能通过结合细菌蛋白失活发挥抗菌。APEC感染定植多脏器致病变，本研究E. coli + BP组肝肺脾负荷显著降低，与姜黄素抑制MRSA肝脏负荷一致；E. coli组门管区炎性浸润，BP组无，表明BP减轻炎性积聚与组织损伤。APEC释放LPS结合TLR4激活NF-κB与MAPK诱导介质过量表达致损伤，白藜芦醇等多酚下调介质表达，本研究E. coli与LPS组介质过表达，BP极显著下调，支持多酚转录水平下调促炎因子发挥抗炎。LPS激活TLR4下游NF-κB与MAPK，NF-κB胞质与IκB结合，刺激下IκB磷酸化降解，NF-κB磷酸化入核转录iNOS、COX-2；MAPK含ERK、p38、JNK调控炎症基因，可通过AP-1独立NF-κB促进炎症，本研究体内感染与体外LPS均增加p65、p38、ERK1/2磷酸化，BP明显减弱，推测BP抑制NF-κB与MAPK依赖AP-1激活双抑制致抗炎。ROS是炎症上游信号，LPS或感染激活NADPH氧化酶与线粒体电子链致ROS爆发，促进NF-κB与MAPK，本研究LPS增加ROS，BP显著减弱，推测BP部分通过降ROS抑制下游通路与介质表达，与SIRT3介导线粒体脂肪酸氧化护肝氧化损伤相呼应。自噬溶酶体系统亦参与病原损伤，AMPK-TFEB信号阻断自噬流损溶酶体加重肾损伤，推测BP或调控AMPK-TFEB-自噬轴需后续验证。局限为腹腔注射建模非自然呼吸道，反映全身播散与肝炎症非呼吸道黏膜效，未设阳性对照无法比标准抗炎药效，但体内外一致结果提供BP抗炎强证据，未来需气管感染与阳性对照验证。
结论部分翻译为：综上所述，BP在体内与体外对APEC感染具强效抗菌与抗炎活性，通过抑制细菌增殖、减少器官定植、抑制NF-κB与MAPK信号通路、下调促炎介质及降低ROS水平减轻组织炎症，这些发现支持BP作为抗生素替代品用于家禽大肠杆菌病防控的潜力。
