从真菌合成到免疫调节：探索生物源银纳米颗粒的安全性、佐剂潜力及对微生物组的影响

《Microbial Biotechnology》：From Mycosynthesis to Immunomodulation: Exploring the Safety, Adjuvant Potential and Microbiota Impact of Biogenic Silver Nanoparticles

　　

亚单位疫苗被认为是最安全的免疫平台，但通常需要佐剂以引发强效免疫应答。尽管纳米颗粒已成为有前景的佐剂，但通过真菌合成（mycosynthesis）产生的生物源银纳米颗粒（AgNPs）在很大程度上仍未被探索。本研究利用Phanerochaete chrysosporium、Penicillium expansum和Punctularia atropurpurascens的本地菌株在三种不同培养基（PDB, MEB, MGYP）中培养，真菌合成了九种不同的AgNPs。真菌合成的AgNPs均呈球形、带负电荷，并在生物分子包被中包含真菌蛋白。此外，尽管体外（in vitro）生物相容性评估显示AgNPs在溶血活性和细胞毒性活性方面存在特异性差异，但在小鼠体内（in vivo）未观察到急性毒性迹象。AgNPs的佐剂潜力在卵清蛋白免疫小鼠中进一步评估，结果显示四种AgNPs表现出显著的免疫增强活性，并具有突出的IgG2a极化效应。佐剂活性和IgG亚类极化活性均呈剂量依赖性。最后，通过粪便微生物组分析评估了选定AgNPs诱导的远端效应。值得注意的是，虽然Firmicutes和Bacteroidota仍为优势菌门，但AgNPs处理组显示出与轻度免疫调节一致的组成变化。总结而言，研究人员在生物相容性、佐剂能力、强效且剂量依赖的IgG2a极化活性以及对肠道微生物组的有限影响方面的结果，支持真菌合成AgNPs作为开发新型疫苗佐剂的通用下一代平台。

**论文解读：从真菌合成到免疫调节——生物源银纳米颗粒的安全性与佐剂潜力**

**研究背景与问题**
亚单位疫苗（subunit vaccine）因其安全性被视为最理想的免疫平台，但通常需要佐剂（adjuvant）来激发强效免疫应答。纳米颗粒（nanoparticle, NP）已展现出作为佐剂的潜力，然而通过真菌合成（mycosynthesis）获得的生物源银纳米颗粒（biogenic silver nanoparticle, AgNP）在这一领域仍鲜有研究。现有少数研究多集中于植物或单一真菌来源的AgNPs，缺乏对不同菌株和培养条件所产生AgNPs的系统比较，且对其安全性、佐剂活性及远端效应（如肠道微生物组影响）的综合评估尚不充分。为此，研究人员开展了此项研究，旨在系统评估真菌合成AgNPs的体内外生物相容性、佐剂活性及对肠道微生物组的潜在影响，为开发新型疫苗佐剂提供依据。该论文发表在《Microbial Biotechnology》。

**主要技术方法**
研究人员利用来自乌拉圭的三种丝状真菌菌株——Phanerochaete chrysosporium、Penicillium expansum和Punctularia atropurpurascens，在三种不同培养基（PDB、MEB、MGYP）中培养，通过真菌合成获得九种AgNPs。采用透射电子显微镜（TEM）分析形态，动态光散射（DLS）测定水合粒径和ζ电位，纳米颗粒追踪分析（NTA）测定颗粒浓度，MicroBCA法量化包被蛋白含量。体外生物相容性通过小鼠红细胞溶血试验（haemolytic activity, HA）和RAW264.7巨噬细胞MTT毒性试验（cytotoxic activity, CA）评估。体内急性毒性试验（ATA）在雌性CD-1小鼠中经皮下（s.c.）注射进行。佐剂活性通过卵清蛋白（OVA）免疫小鼠模型评估，ELISA检测血清OVA特异性IgG及亚类（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3）。远端效应通过粪便微生物组16S rRNA基因扩增子测序（Illumina MiSeq）分析，使用DADA2、Phyloseq和DESeq2进行生物信息学处理。

**研究结果**
**3.1 真菌合成与AgNPs表征**
通过三种真菌和三种培养基组合，成功合成九种AgNPs，其中六种（来自MEB和MGYP培养基）为首次报道。所有AgNPs呈球形，带负电荷，水合粒径在7–78 nm之间，ζ电位为?16.9至?22.9 mV，表明胶体稳定性良好。包被蛋白含量在3.7–125.3 fg/AgNP之间，随菌株和培养基变化，Pe来源AgNPs蛋白含量较高。产量（每克真菌生物量产生的AgNPs）差异显著，PaPDB产量最高（2.3×10¹¹ NPs/g），PchMEB最低（6.5×10⁸ NPs/g）。

**3.2 AgNPs的生物相容性评估**
体外溶血试验显示，HA₅₀值（50%溶血浓度）在6.5×10⁷至>1.0×10⁹ NPs/mL之间，Pch和Pe来源分别具有最高和最低溶血活性。细胞毒性试验中，CA₅₀值（50%细胞活力抑制浓度）在3.0×10⁷至>1.0×10⁹ NPs/mL之间，Pe来源AgNPs细胞毒性最低。体内急性毒性试验中，所有AgNPs在10倍剂量（2.0×10¹⁰ NPs/kg）下均未引起小鼠死亡或毒性症状，体重增长与对照组无显著差异；PchPDB和PaPDB在200倍剂量下同样安全。

**3.3 AgNPs佐剂活性筛选**
在OVA免疫小鼠模型中，以1倍剂量（2.0×10⁹ NPs/kg）评估九种AgNPs的佐剂活性。结果显示，六种AgNPs显著调节OVA特异性IgG水平：PePDB及三种Pa来源AgNPs（PaPDB、PaMEB、PaMGYP）表现出佐剂样活性，促进IgG升高（6–9倍）；而PeMGYP和PchMGYP则显示免疫抑制样效应（下降0.2–0.4倍）。IgG亚类分析表明，具有佐剂活性的AgNPs（尤其是Pa来源）强烈极化抗体反应向IgG2a，与Alum诱导的混合型IgG反应不同。

**3.4 AgNPs呈剂量依赖性佐剂活性**
选择PaPDB（1倍剂量下具佐剂活性）和PchPDB（1倍剂量下无活性）进行剂量递增实验（1×、6×、60×、100×剂量）。PaPDB在1×–60×剂量下显著增强IgG（中位数升高6.2–7.9倍），但100×剂量下活性丧失；PchPDB在60×和100×剂量下才显示免疫增强（中位数升高15.1–16.3倍），表明佐剂活性呈剂量依赖性且可能存在饱和效应。IgG亚类极化也呈剂量依赖性：PaPDB在高剂量下诱导IgG2b和IgG3，但IgG2a诱导下降；PchPDB在高剂量下显著增加所有检测亚类。

**3.5 AgNPs对粪便微生物组的远端效应**
对免疫小鼠（100×剂量）的粪便微生物组分析显示，α多样性指数（观察ASV数、Shannon、Simpson）在各组间无显著差异。β多样性分析（Bray-Curtis距离）显示生理盐水组与Alum/AgNP组分离，但PERMANOVA未达显著水平（p>0.05）。门水平上，Firmicutes和Bacteroidota为优势菌门，AgNP处理组Firmicutes/Bacteroidota比值降低（生理盐水组3.07，Alum组0.48，PchPDB组0.84，PaPDB组0.33），表明向Bacteroidota偏移。差异丰度分析（DESeq2）显示处理特异性变化：PaPDB增加Atopobiaceae、Coriobacteriaceae和Eggerthellaceae，减少Lactobacillaceae；Alum增加Christensenellaceae和Marinifilaceae；PchPDB增加Mycoplasmataceae，减少Ruminococcaceae。共同变化包括Muribaculaceae增加和Rikenellaceae减少。

**讨论与结论**
讨论部分指出，真菌合成AgNPs的理化性质（如粒径、包被蛋白含量）和生物活性显著受菌株和培养条件影响，其中Pa来源AgNPs在佐剂活性上表现一致，而Pe来源AgNPs毒性最低。AgNPs的佐剂活性与IgG2a极化密切相关，且呈剂量依赖性，提示其功能多样性和潜在的抗原节减效应。对肠道微生物组的远端效应显示，尽管皮下注射，AgNPs仍可调节菌群组成，但影响程度与Alum类似，未引起严重失调。结论部分翻译如下：总之，本研究结果强烈支持真菌合成AgNPs作为开发安全、功能多样的疫苗佐剂的新型生物技术平台。研究人员的发现表明，真菌合成AgNPs具有有趣的剂量依赖性免疫增强活性，同时在IgG亚类极化方面表现出卓越的功能多样性。此外，选定AgNPs对肠道微生物组组成产生远端效应，其方式既有与经典Alum相似之处，也遵循AgNPs特异性模式；这凸显了在评估新型纳米材料疗法时考虑宿主-微生物组相互作用的重要性。该结果为微生物组研究与转化免疫学及应用纳米技术交叉领域的不断增长提供了重要贡献。