拟南芥tRNA剪接内切酶复合物的(αβ)2架构：结构建模与进化分析

《Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics》：An (αβ)2 Architecture of the Arabidopsis thalianatRNA Splicing Endonuclease Complex: Structural Modeling and Evolutionary Analyses

　　

tRNA剪接内切酶（TSEN）在真核生物和古菌中从前体tRNA（pre-tRNA）中去除内含子，但植物TSEN的架构和亚基组织仍不清楚。在此，研究人员整合了植物体内双分子荧光互补（BiFC）实验、基于AlphaFold3（AF3）的结构建模、分子动力学模拟、分子力学广义Born表面积（MMGBSA）分解和ConSurf分析，以表征拟南芥TSEN复合物（AtTSEN），重点关注AtTSEN1、AtTSEN2和AtTSEN54。基于序列和结构的同源搜索未检测到典型的TSEN15同源物（一种在酵母和人类TSEN中保守的结构亚基）。BiFC支持AtTSEN54与催化亚基AtTSEN1和AtTSEN2之间的成对相互作用，但不支持AtTSEN1与AtTSEN2之间的相互作用，表明AtTSEN54介导的异二聚体配对。AF3多聚体建模预测AtTSEN具有伪对称的古菌样（αβ）²架构，而非典型的真核αβγδ排列。在AF3 pre-tRNA结合模型中，AtTSEN54位于pre-tRNA肘部附近，而含内含子的反密码子臂不对称地朝向AtTSEN1催化位点。逐残基MMGBSA分解鉴定出碱性蛋白质残基（特别是Arg和Lys）作为推定的pre-tRNA结合热点，其中许多对应植物、真菌和后生动物TSEN复合物中进化上保守的界面位置。总之，这些发现支持AtTSEN的古菌样（αβ）²结构模型，并表明共享的RNA结合特征与植物特异性TSEN架构重塑并存。

**论文解读：拟南芥tRNA剪接内切酶复合物的(αβ)²架构与进化分析**

**研究背景与科学问题**
tRNA剪接内切酶（TSEN）在真核生物和古菌中负责从前体tRNA（pre-tRNA）中切除内含子，是所有含内含子tRNA成熟的关键酶。在酵母和人类中，TSEN复合物已明确为异四聚体（αβγδ），由催化亚基（TSEN2和TSEN34）和结构亚基（TSEN15和TSEN54）组成。然而，植物TSEN的亚基组成、三维结构和pre-tRNA识别机制长期未明。拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）中，催化亚基AtTSEN1和AtTSEN2高度同源（约72%序列同一性），但缺乏对TSEN15同源物的鉴定。此外，植物pre-tRNA内含子通常较短（11–25 nt），且主要存在于延伸子tRNA^Met和tRNA^Tyr中，其剪接效率受D-茎和A-I螺旋长度调控，但完整的复合物架构未知。为此，研究人员整合了实验与计算手段，旨在阐明AtTSEN的亚基组织、空间结构及与pre-tRNA的相互作用模式。

**研究意义**
该研究首次提出拟南芥TSEN复合物采用古菌样（αβ）²异四聚体架构，而非典型的真核αβγδ排列，并揭示了植物特异性亚基重塑与保守RNA结合特征之间的共存关系。论文发表在《Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics》。

**主要技术方法**
研究人员采用植物体内双分子荧光互补（BiFC）实验（在洋葱表皮细胞中瞬时表达分裂Venus融合蛋白）检测AtTSEN亚基间的成对相互作用；利用AlphaFold3（AF3）进行多聚体结构建模，预测AtTSEN复合物及其与pre-tRNA^Tyr的结合模式；通过分子动力学（MD）模拟（100 ns，AMBER99SB-ILDN力场）和分子力学广义Born表面积（MMGBSA）分解计算结合自由能并识别关键残基；结合ConSurf进化保守性分析评估界面残基的保守性。所有计算模型均基于UniProt和GtRNAdb数据库中的序列。

**研究结果**
*3.1 AtTSEN54在结构上更接近HsTSEN54而非ScTSEN54*
通过基于结构的同源搜索（Foldseek），研究人员鉴定出AtTSEN54候选（Q6DBN3），其与人类HsTSEN54的N端结构域（NTD）高度相似（RMSD～1.17 ?），而与酵母ScTSEN54差异较大（RMSD～23.2 ?），尽管序列同一性均低（约23%）。同时，序列和结构搜索均未在拟南芥或其他陆地植物中发现典型的TSEN15同源物，仅在绿藻*Chlamydomonas eustigma*中检测到部分相似蛋白（CeTSEN15）。

*3.2 AtTSEN54在植物体内与AtTSEN1和AtTSEN2均相互作用*
BiFC实验显示，共表达AtTSEN54与AtTSEN1或AtTSEN2时，在洋葱表皮细胞中观察到显著的Venus荧光信号，而AtTSEN1与AtTSEN2共表达无信号，表明AtTSEN54介导催化亚基的异源二聚化，催化亚基之间无直接相互作用。

*3.3 AF3预测AtTSEN为(αβ)₂型四聚体*
AF3多聚体模型显示，两个AtTSEN1（催化α型）和两个AtTSEN54（结构β型）形成伪对称的(αβ)₂四聚体，通过C端反平行β-β界面稳定。该架构与古菌*Aeropyrum pernix*和*Archaeoglobus fulgidus*的TSEN结构高度相似（RMSD～3.16–3.35 ?），且催化三联体Y148-H156-K190与古菌的Y249-H260-K290重叠。

*3.4 AF3建模提示保守的pre-tRNA定位与静电互补性*
在AF3预结合的AtTSEN–pre-tRNA^Tyr模型中，pre-tRNA沿复合物表面沟槽排列：AtTSEN54靠近pre-tRNA肘部区域，含内含子的反密码子臂朝向AtTSEN1催化位点。与人类HSEN–pre-tRNA^Arg冷冻电镜结构（PDB: 8HMY）的叠加显示，成熟tRNA主体和亚基总体布局保守，但含内含子臂的柔性区域导致整体RNA RMSD较大（～33.6 ?）。静电势（ESP）分析显示，所有三种TSEN–pre-tRNA复合物均呈现正电性表面沟槽，与负电性RNA骨架互补。

*3.5 结合自由能分解揭示碱性残基为TSEN–pre-tRNA界面的主要热点贡献者*
MD模拟（100 ns）后，MMGBSA分解（70–100 ns窗口）显示，AtTSEN–pre-tRNA^Tyr的总结合自由能为-362.71 kcal mol^?1。逐残基分析表明，优势贡献来自碱性残基Arg和Lys：AtTSEN1的R231、K6、R183靠近剪接位点，AtTSEN54的K61贡献最大；人类HSEN中HSEN2的Y16、R13和HSEN54的R202、K97贡献突出，而HSEN15仅有一个残基（R171）进入前列；酵母中ScTSEN54的R50、K458和ScTSEN2的R374、R376、R369贡献最大。ConSurf分析显示，多数强贡献残基对应于进化上高度保守的位置（等级7–9），而外围界面残基变异较大。这些结果支持TSEN–pre-tRNA界面存在保守的碱性残基网络。

**讨论与结论**
BiFC实验表明AtTSEN54作为支架连接催化亚基，与酵母和人类中异二聚体配对逻辑一致。结构建模和古菌TSEN的叠加证实AtTSEN采用(αβ)₂架构，与典型真核αβγδ排列不同，且缺乏可检测的TSEN15同源物，提示陆地植物中可能发生了结构亚基的丢失或功能替代。pre-tRNA结合模型将AtTSEN54置于肘部结合位置，催化亚基不对称地对应5'和3'剪接位点，与人类TSEN功能相似。MMGBSA和ConSurf的联合分析揭示了由碱性残基主导的保守RNA结合界面，而植物特异性重塑体现在外周结构域的变化。研究结论指出：AtTSEN复合物采用古菌样(αβ)₂异四聚体模型，由两个结构相似的αβ异二聚体组成，在pre-tRNA结合状态下呈现功能非对称性；共享的RNA结合特征（如碱性热点和静电互补性）在植物、真菌和动物中保守，而植物特异性亚基排列可能反映了对短内含子pre-tRNA底物的适应。该模型为后续的体内验证（如免疫共沉淀）、体外重建和冷冻电镜结构解析提供了可检验的假设，并拓展了对真核TSEN进化多样性的理解。