《Protein Science》：RINAMI: Residue-attributed interpretable neural network for predicting absolute folding free energy by merging structure and sequence information
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近年来，de novo蛋白质设计的进展使得生成多样化的新型蛋白质成为可能。然而，一个基本挑战仍然存在：即使氨基酸序列被设计为以目标结构作为最稳定构象，目前仍没有可靠的计算方法来评估目标结构相对于替代构象是否足够稳定。虽然实验实现预期折叠需要目标结构在热力学上由
近年来，de novo蛋白质设计的进展使得生成多样化的新型蛋白质成为可能。然而，一个基本挑战仍然存在：即使氨基酸序列被设计为以目标结构作为最稳定构象，目前仍没有可靠的计算方法来评估目标结构相对于替代构象是否足够稳定。虽然实验实现预期折叠需要目标结构在热力学上由较大的自由能隙所 favor，但缺乏折叠稳定性的定量度量使得难以区分可靠与不可靠的设计。在此，研究人员提出了RINAMI（Residue-attributed Interpretable Neural network for predicting Absolute folding free energy by Merging structure and sequence Information），一个机器学习模型，从蛋白质的三维结构和氨基酸序列预测绝对折叠自由能（ΔG）。RINAMI通过多头交叉注意力机制整合来自ProteinMPNN和ESM2（Evolutionary Scale Modeling 2）的结构和序列表示，该机制在结构环境中上下文化序列衍生的信号。在Mega-scale和Maxwell数据集上的自然和设计蛋白质的基准测试显示，RINAMI优于测试的现有方法，与实验测量值达到更高的相关性，并具有改进或相当的预测误差。消融研究支持序列-结构整合对预测准确性的贡献。此外，RINAMI通过捕捉关键物理化学效应展现出强大的可解释性，包括埋藏亲水残基的去稳定效应、埋藏疏水残基的稳定效应以及半胱氨酸的特性。总之，这些结果确立了RINAMI作为ΔG预测的准确且可解释的框架，并为在实验测试之前评估和优先排序蛋白质设计提供了实用的计算工具。
**研究背景与问题**
近年来，基于机器学习的de novo蛋白质设计技术取得了显著进展，能够生成大量新型蛋白质。然而，实验成功率仍然很低（常低于10%），主要原因是许多设计序列无法稳定地采用目标构象，导致表达不稳定、聚集等问题。提高设计效率的关键在于，在实验前预测目标结构是否在热力学上被足够大的自由能隙所 favor，即预测绝对折叠自由能（ΔG）。目前缺乏可靠的计算工具来评估折叠稳定性：AlphaFold2的置信度分数（如pLDDT）与实验ΔG不相关，而现有基于机器学习的ΔG预测方法（如Cagiada等基于ESM-IF的方法）在变体蛋白和突变诱导稳定性变化上精度有限。因此，需开发一种更鲁棒、更灵敏的ΔG预测方法，适用于多种蛋白质及其变体。
**研究内容与结论**
研究人员提出了RINAMI（Residue-attributed Interpretable Neural network for predicting Absolute folding free energy by Merging structure and sequence Information），一种通过融合结构信息和序列信息预测绝对折叠自由能（ΔG）的机器学习模型。RINAMI利用ProteinMPNN编码结构表示，利用ESM2（Evolutionary Scale Modeling 2）编码序列表示，并通过多头交叉注意力机制将序列信息用于重新加权结构表示，最终生成残基-氨基酸-ΔG矩阵并求和得到全局ΔG。在Mega-scale数据集（Tsuboyama等)和Maxwell数据集（Maxwell等)上的基准测试表明，RINAMI在皮尔逊相关系数（Pearson's R）、斯皮尔曼秩相关系数（Spearman's R）、均方根误差（RMSE）和平均绝对误差（MAE）上均优于Rosetta能量分数和Cagiada等的方法。消融实验证实序列-结构整合显著提升了预测精度。残基级分析显示，RINAMI能捕捉关键物理化学效应：埋藏亲水残基的去稳定化、埋藏疏水残基的稳定化以及半胱氨酸的特性（尤其是二硫键形成）。折叠性预测任务中，RINAMI对中小型蛋白质（<180残基）优于AlphaFold2和ESMFold的pLDDT，但对大型蛋白质（>180残基）性能下降。该论文发表在《Protein Science》。
**主要关键技术方法**
研究人员使用ESM2（一种蛋白质语言模型）从氨基酸序列提取上下文依赖的表示（320维向量）；使用ProteinMPNN（一种基于消息传递神经网络的序列设计模型）从蛋白质主链结构提取节点表示（128维向量）和输出概率分布（20维向量），二者拼接成统一的结构表示（148维）。通过多头交叉注意力机制，以序列表示作为查询（Q），结构表示作为键（K）和值（V），重新加权结构表示，再通过多层感知机（MLP）生成残基-氨基酸-ΔG矩阵，每个元素对应特定残基位置特定氨基酸的偏ΔG分数，求和得到全局ΔG。训练数据来自Mega-scale数据集（Tsuboyama等，2023），包含数百个小蛋白质域及其变体的实验ΔG测量值；外部验证使用Maxwell数据集（Maxwell等，2005，22个天然蛋白质）和Garcia数据集（Garcia等，2025，397个de novo设计蛋白）。结构预测全部使用ESMFold完成。
**研究结果**
2.1 RINAMI的架构与训练：RINAMI由ESM2和ProteinMPNN分别提取序列和结构表示，通过多头交叉注意力整合，生成残基-氨基酸-ΔG矩阵，求和得到全局ΔG。训练时采用多任务学习策略，交替进行折叠性预测任务（二分类）和ΔG回归任务，并使用Mega-scale数据集中带截断标签（ΔG > 5 kcal/mol或ΔG < ?1 kcal/mol）的样本平衡类别。数据按序列聚类（MMseqs2，25%序列同一性，80%覆盖）以8:1:1划分训练/验证/测试集，共3个独立划分。
2.2 RINAMI的ΔG预测准确度评估与现有方法比较：在Mega-scale测试子数据集（约66,000个样本）和Maxwell数据集（23个蛋白质）上，RINAMI的皮尔逊R和斯皮尔曼R均高于Rosetta能量分数和Cagiada等的方法，RMSE均低于Cagiada等方法，MAE在Mega-scale上更低，在Maxwell上相当。Bootstrap分析显示，Mega-scale上95%置信区间窄且无重叠，支持RINAMI的统计显著改进；Maxwell由于样本量小，置信区间宽，相关性指标仍优于现有方法。
2.3 氨基酸表示与结构表示的结合提高了预测准确性：消融实验将多头交叉注意力替换为仅处理结构表示的MLP，在Mega-scale测试集上RINAMI的Pearson's R、Spearman's R、RMSE和MAE均优于基线模型，Wilcoxon符号秩检验p值均<0.01；在Maxwell数据集上MAE降低但未达统计显著（p=0.1），表明序列-结构整合在大规模基准上有效。
2.4 RINAMI捕捉了单个氨基酸对蛋白质稳定性的物理化学贡献：分析104个野生型蛋白质的残基-氨基酸-ΔG矩阵，发现：埋藏亲水残基的偏ΔG分数低于暴露亲水残基，反映去稳定效应；埋藏疏水残基的偏ΔG分数高于暴露疏水残基，反映稳定效应；半胱氨酸不论埋藏与否均有高偏ΔG分数，暴露半胱氨酸贡献更大，符合二硫键形成。对于每个野生型蛋白，单突变导致的ΔΔG与偏ΔG分数差值的皮尔逊R和斯皮尔曼R超过0.5的蛋白超过半数，表明RINAMI能捕捉突变诱导的稳定性变化。
2.5 RINAMI对大型蛋白质的性能低于小型蛋白质：在Garcia数据集（397个de novo设计蛋白，长度58-193残基）的折叠性预测任务中，RINAMI将ΔG通过sigmoid映射为折叠概率，以ROC-AUC评估。对于≤180残基的蛋白，RINAMI的AUC高于AF2 pLDDT和ESMFold pLDDT；对于>180残基的蛋白，RINAMI性能下降，主要归因于训练数据偏向小蛋白（Mega-scale主要为40-72残基）。多域蛋白和大型蛋白的应用需谨慎。
**讨论与结论**
讨论部分指出，RINAMI通过整合序列和结构信息，在中小型蛋白的ΔG预测上优于现有方法，但推理时间约为Cagiada方法的1.5倍。消融实验和残基级分析验证了序列-结构融合和可解释性的优势。局限性包括：对大型蛋白（>180残基）性能下降，受限于训练数据偏向小蛋白；依赖ESMFold预测结构，结构误差可能传播至ΔG预测（如结构表示打乱实验显示准确度大幅下降）。未来改进方向包括：更准确的结构预测方法（如捕捉突变诱导的细微结构变化）；融合物理基能量势和模拟信息（如分子动力学导出的构象系综、正常模式特征等）以增强鲁棒性和泛化能力。此外，引入MD信息或基于系综的机器学习方法（如Flexpert-3D、AlphaFlow）有望提升模型对动态性质的捕捉。
**结论**：总之，尽管仍需进一步改进，RINAMI为中小型蛋白质的ΔG预测提供了一种改进且可解释的方法，并作为蛋白质设计和稳定性评估的有价值的计算工具。
