《Reproductive Medicine and Biology》：Epigenetic Changes in the Mature Uterus Following Neonatal Feeding of Tamoxifen in Female ICR Mice
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目的：评估新生期暴露于他莫昔芬（tamoxifen）后雌性ICR小鼠子宫中参与表观遗传调控（epigenetic regulation）的蛋白的免疫表达变化。方法：将32只新生小鼠随机分为2组：对照组和他莫昔芬处理组。在出生后第5天和第42天，每组各取8只小鼠
目的：评估新生期暴露于他莫昔芬（tamoxifen）后雌性ICR小鼠子宫中参与表观遗传调控（epigenetic regulation）的蛋白的免疫表达变化。方法：将32只新生小鼠随机分为2组：对照组和他莫昔芬处理组。在出生后第5天和第42天，每组各取8只小鼠处死，摘取其子宫组织并进行组织学和免疫组化（immunohistochemistry, IHC）分析。评估了组蛋白去乙酰化酶1-3（Hdac1-3）、DNA甲基转移酶1（Dnmt1）、DNA甲基转移酶3A（Dnmt3a）、赖氨酸乙酰转移酶2A（Kat2a）、常染色质组蛋白赖氨酸甲基转移酶2（Ehmt2）、赖氨酸脱甲基酶6B（Jmjd3）、SET结构域分叉组蛋白赖氨酸甲基转移酶1（Setdb1）、Zeste同源物增强子2（Ezh2）、Zeste 12抑制子（Suz12）、十-十一易位双加氧酶1-3（Tet1-3）以及Six1（一种已知可调节发育性暴露于外源性雌激素后子宫内膜异常的雌激素响应蛋白）的免疫染色。结果：在成年期，他莫昔芬暴露小鼠的子宫内膜中Hdac1、Setdb1、Suz12、Dnmt1、Dnmt3a和Six1的染色升高，而Hdac3、Kat2a、Ezh2、Jmjd3和Tet1的染色降低。在肌层中，Dnmt1、Dnmt3a和Six1染色升高，而Hdac3、Kat2a和Jmjd3染色降低。结论：新生期他莫昔芬暴露诱导雌性ICR/CD-1小鼠子宫表观遗传调节因子可能持续重塑以及Six1过表达，尤其在子宫内膜中。总之，这些发现表明雌性ICR/CD-1小鼠新生期他莫昔芬暴露不仅诱导腺肌症（adenomyosis），还可能在生殖道中留下持久的暴露印记。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
腺肌症（adenomyosis）是一种常见子宫疾病，影响育龄期女性，表现为痛经、盆腔痛、月经过多和不孕。尽管其发病率高，但病因和病理生理机制仍不明确。传统上，医源性子宫操作导致的子宫内膜-肌层界面破坏（endometrial-myometrial interface disruption, EMID）被认为是Kishi I型腺肌症的病因，但其他类型腺肌症的发病机制尚不清楚。动物模型是研究腺肌症的重要工具，其中新生期喂养他莫昔芬（tamoxifen, TAM）的CD-1小鼠模型自2001年建立以来被广泛使用，因其诱导成功率高、成本低。然而，该模型的一个隐含假设——所有观察到的分子和病理变化直接归因于腺肌症本身——尚未被验证。TAM属于选择性雌激素受体调节剂（selective estrogen receptor modulators, SERMs），新生期暴露可能通过表观遗传机制（epigenetic mechanisms）改变雌激素信号通路，类似其他外源性雌激素（如己烯雌酚、双酚A）的发育暴露效应。因此，研究人员开展本研究，旨在验证新生期TAM喂养是否能诱导成熟子宫中表观遗传调控蛋白的改变，并探讨其与腺肌症发生的关联。
**研究内容与结论**
研究人员将32只新生期雌性ICR小鼠随机分为对照组和TAM处理组，在出生后第1至5天口服TAM（1 mg/kg）。在新生期（PND5）和性成熟期（PND42）分别处死8只小鼠，收集子宫组织进行组织学和免疫组化（IHC）分析。评估了15种表观遗传调控相关蛋白（Hdac1-3、Kat2a、Ezh2、Suz12、Ehmt2、Setdb1、Jmjd3、Dnmt1、Dnmt3a、Tet1-3）及雌激素响应蛋白Six1的免疫表达。结果显示，TAM暴露组在PND42时37.5%的小鼠出现浅表腺肌症样病变。多重线性回归分析表明，TAM暴露显著改变了12种蛋白的表达，且具有时间、组织类型和暴露-组织交互效应。在成年期子宫内膜中，Hdac1、Setdb1、Suz12、Dnmt1、Dnmt3a和Six1表达升高，而Hdac3、Kat2a、Ezh2、Jmjd3和Tet1表达降低；肌层中Dnmt1、Dnmt3a和Six1升高，Hdac3、Kat2a和Jmjd3降低。层次聚类分析显示，这些改变呈现模块化模式：激活染色质沉默的调节因子（如Dnmt1/3a、Hdac1、Setdb1、Suz12）上调，而转录激活或去甲基化因子（如Tet1、Kat2a、Jmjd3）下调，同时Six1持续升高。在TAM组内，腺肌症小鼠与无腺肌症小鼠的比较显示，仅Hdac2、Ezh2和Six1表达存在显著差异，其中Ezh2降低与腺肌症发生相关，而Six1升高在腺肌症小鼠中更为显著。KEGG和GO功能注释分析表明，成年期子宫内膜中改变的蛋白主要富集于“Polycomb repressive complex”通路及染色质/组蛋白调控相关生物学过程。总之，新生期TAM暴露诱导子宫表观遗传调节因子持续重塑，尤其在子宫内膜中，且Six1的过表达提示雌激素响应信号异常。这些发现表明，TAM暴露不仅诱导腺肌症，还在生殖道中留下持久印记，挑战了该模型作为单纯“病变驱动”模型的解释。论文发表在《Reproductive Medicine and Biology》。
**关键技术方法**
研究人员使用ICR小鼠（与CD-1品系密切相关）作为模型，从上海杰思捷实验动物公司购买。主要技术方法包括：新生期口服TAM（1 mg/kg，PND1-5）建立暴露模型；在PND5和PND42两个时间点采集子宫组织；进行组织学（H&E染色）评估腺肌症样病变；采用免疫组化（IHC）检测15种表观遗传调控蛋白（Hdac1-3、Kat2a、Ezh2、Suz12、Ehmt2、Setdb1、Jmjd3、Dnmt1、Dnmt3a、Tet1-3）和Six1的免疫表达，使用Image-Pro Plus 6.0软件计算平均光密度（MOD）进行定量；通过多重线性回归分析评估TAM暴露、时间、组织类型及交互效应；采用层次聚类和KEGG/GO富集分析对成年期子宫中改变的蛋白进行功能注释。
**研究结果**
**3.1 免疫组化分析**
所有小鼠存活。14种蛋白在子宫内膜和肌层中均有表达，呈核或核-浆定位模式。在PND42时，TAM暴露组3/8只小鼠出现局灶性浅表腺肌症样病变（Grade 1级），对照组未见。除Setdb1外，所有蛋白在子宫内膜中的染色水平显著高于肌层（p≤0.0003），且子宫内膜与肌层染色水平呈正相关（r≥0.47, p≤0.0063）。
**3.2 新生期（PND5）变化**
在PND5时，TAM组子宫内膜中Hdac1、Setdb1、Ehmt2、Suz12、Dnmt3a和Six1染色显著升高，而Ezh2、Jmjd3和Tet1染色降低（p≤0.015）。肌层中仅Hdac1、Dnmt1和Dnmt3a升高，Setdb1降低（p≤0.0498）。
**3.3 成年期（PND42）变化**
在PND42时，TAM组子宫内膜中Hdac1、Setdb1、Suz12、Dnmt1、Dnmt3a和Six1染色升高，Hdac3、Kat2a、Ezh2、Jmjd3和Tet1染色降低（p≤0.0498）。肌层中Dnmt1、Dnmt3a和Six1升高，Hdac3、Kat2a和Jmjd3降低（p≤0.021）。总体而言，成年期改变的蛋白数量多于新生期。
**3.4 腺肌症对蛋白表达的影响**
在TAM组内，有腺肌症的小鼠与无腺肌症者相比，仅Hdac2、Ezh2和Six1染色存在显著差异：有腺肌症小鼠Hdac2升高（p=0.036），Ezh2降低（p=0.049），Six1进一步升高（p=0.036）。表明Ezh2降低与腺肌症发生相关，而Six1升高在腺肌症中更为显著。
**3.5 功能注释**
KEGG分析显示子宫内膜中改变的蛋白富集于“Polycomb repressive complex”和“甲状腺激素信号通路”等；GO分析富集于染色质重塑、组蛋白修饰、甲基化、对BPA响应及上皮发育等生物学过程。肌层中无显著富集。
**讨论与结论**
讨论部分指出，新生期TAM暴露诱导的表观遗传变化与发育性外源性雌激素暴露的已知效应一致，表现为DNA甲基化、组蛋白乙酰化和甲基化修饰的协调扰动，可能促进染色质凝聚和转录抑制。这些变化在腺肌症病变出现前已可检测（除Ezh2外），提示TAM暴露本身可能直接导致表观遗传重塑，而非单纯由腺肌症引起。Six1的持续上调可能通过促进上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）增强子宫内膜侵袭性，参与腺肌症发病。研究人员强调，该模型的使用应谨慎，因为TAM暴露的印记效应可能混淆对腺肌症本身机制的解释，建议采用机械损伤模型等替代模型进行交叉验证。研究结论翻译如下：
总之，新生期他莫昔芬暴露诱导雌性ICR/CD-1小鼠子宫表观遗传调节因子在早期和成年期重塑，尤其在子宫内膜中。特别是，Six1作为雌激素响应指标在成年期持续升高，与多个表观遗传调节因子的协同模块化异常同时发生。这些发现共同表明，ICR/CD-1小鼠新生期TAM暴露不仅诱导腺肌症，还在成熟生殖道中留下可能持久的暴露印记。虽然该腺肌症模型易于使用且成本低，有助于理解腺肌症发病机制，但在研究中使用时应极其谨慎，因为对数据的合理解释及与人类腺肌症相关性的评估需要明确模型边界并在多个腺肌症模型间交叉验证关键结论。
