《South African Journal of Botany》：Callus-mediated high-frequency plant regeneration, physio-chemical analysis and start codon targeted (SCoT) genetic homogeneity assessment in Centella asiatica L?
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Irfan Bashir Ganie|Anwar Shahzad|Adla Wasi|Sabaha Tahseen•建立了高效的愈伤组织介导的积雪草间接再生方法。•GA?、硫酸腺嘌呤和谷氨酰胺显著促进了芽的增殖与形态发育。•再生的小植株具有较高的生理活力，在驯化过程中存活率良好。
Irfan Bashir Ganie|Anwar Shahzad|Adla Wasi|Sabaha Tahseen
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建立了高效的愈伤组织介导的积雪草间接再生方法。
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GA?、硫酸腺嘌呤和谷氨酰胺显著促进了芽的增殖与形态发育。
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再生的小植株具有较高的生理活力，在驯化过程中存活率良好。
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SCoT标记分析证实了其遗传稳定性以及克隆的真实性。
引言
积雪草L. Urban（CA），又称积雪草或印度金钱草，是伞形科的一种多年生匍匐药用植物。由于其富含三萜类化合物（如积雪草苷、马齿苋素、积雪草酸和马齿苋酸）、黄酮类化合物、维生素以及精油等活性成分，因此具有重要的药理和营养价值（Gray等人，2018；Gamage等人，2021；Diniz等人，2023）。在传统医学中，该植物被用于阿育吠陀医学、中医以及非洲传统医学中，可用于改善记忆力、治疗高血压、皮肤疾病以及促进伤口愈合（Oyenihi等人，2023；Ganie等人，2022）。此外，以积雪草叶片制成的草药糖浆或外用药膏也被用来缓解咳嗽、头痛以及骨折症状（Chandrika & Kumara，2015；Bhavna & Jyoti，2011）。该植物还对哮喘、肿瘤、胃部疾病以及麻风病具有治疗作用（Rahmatullah等人，2010；Bandara，2011）。在东亚和东南亚国家，积雪草还被用作草药茶或汁液饮用（Bandara等人，2011）。然而，由于商业和制药领域的需求不断增加，再加上栖息地环境恶化，导致该植物在其自然生长区域遭到过度采挖，使得这一物种在多个地区面临生存威胁（Naidu等人，2010）。
通过种子或匍匐茎进行积雪草的传统繁殖方式效率较低，因为其发芽率低且营养繁殖能力有限。尽管已有研究报道过通过叶片或节段外植体直接进行器官发生，但这些方法往往存在芽诱导频率低、植株生长受阻以及叶状体扩展不良等问题，难以实现大规模繁殖（Mohapatra等人，2008；Wongsa等人，2023）。同样，通过愈伤组织进行间接再生也有所尝试，但常常会出现植株生长迟缓、基部形成愈伤组织、过度吸水以及生根效率低下等形态异常现象，从而影响小植株的存活率和一致性（Gururajan等人，2021）。因此，积雪草微繁殖面临的另一个挑战就是如何建立一种可重复、形态稳定且遗传均匀的再生方法。
除了优化植物生长调节剂之外，添加硫酸腺嘌呤和谷氨酰胺等生长添加剂也能显著提升组织培养的效果。硫酸腺嘌呤作为一种嘌呤衍生物，能够增强细胞分裂素的作用，促进细胞分裂、叶绿素合成以及芽的伸长（George等人，2007；Siwach & Gill，2011；Mohammed等人，2021）。而谷氨酰胺则作为一种有机氮源，可通过促进氨基酸和蛋白质的合成来刺激愈伤组织的增殖以及芽的分化，尤其适用于那些容易发生玻璃化的培养体系（Bhojwani & Razdan，1986；Greenwell & Ruter，2018）。因此，人们推测，添加这些物质有助于维持正常的代谢平衡和细胞分化，从而缓解植株生长迟缓、基部愈伤组织形成以及叶状体扩展不良等问题。
此外，了解从体外培养到离体培养过程中所发生的生理和生化变化至关重要，因为小植株会在光照强度、湿度以及气体交换等方面发生巨大变化，而这些因素又会影响到光合色素的合成、抗氧化防御能力以及水分平衡。因此，通过评估这些变化，可以找出植株驯化过程中的限制因素，进而制定出更有效的方案，提高植株在驯化过程中的存活率（Hazarika，2006）。
目前还没有研究系统地探讨过将GA?、谷氨酰胺和硫酸腺嘌呤作为生长添加剂，与优化植物生长调节剂结合使用，以解决积雪草在培养过程中出现的各种异常问题。因此，我们推测，将这些添加剂与优化后的细胞分裂素浓度共同使用，有望抑制形态异常，提升芽的质量，并提高小植株在驯化过程中的适应性。为填补这一研究空白并验证这一假设，本研究旨在通过优化植物生长调节剂，并研究硫酸腺嘌呤、谷氨酰胺以及GA?在促进形态正常的芽增殖方面的协同作用，从而建立一种高效的积雪草间接再生体系。此外，本研究还检测了再生植株在驯化过程中的生理活力，并利用Start Codon Targeted（SCoT）标记来评估其遗传稳定性，以确保克隆植株的一致性。SCoT标记已被广泛用于评估多种植物的遗传多样性和遗传稳定性（Ahmad等人，2019；Anam等人，2024）。这种综合性的研究方法为大规模繁殖这种具有重要药用价值且面临生存威胁的植物提供了有力的支持。
章节摘要
植物材料与来源
本研究使用的成熟健康积雪草叶片，采集自印度北方邦阿里格尔市阿里格尔穆斯林大学植物学系的温室中的植株。该物种已经过分类学鉴定，相应的模式标本也被保存在该大学的植物标本馆中，以供后续参考。所有试剂以及培养基成分均为分析级产品。研究中使用的培养基为Murashige和Skoog（MS）基础培养基，此外还使用了包括6-苄氨基嘌呤在内的多种植物生长调节剂。
愈伤组织诱导
将积雪草叶片外植体接种在添加了不同浓度及组合的植物生长调节剂的MS培养基上后，表现出不同的愈伤组织诱导反应。在含有植物生长调节剂的培养基中，愈伤组织开始形成的时间通常在接种后14天内，而未添加任何植物生长调节剂的MS培养基则无法诱导愈伤组织形成。愈伤组织的发育程度会随着植物生长调节剂的种类和浓度的不同而有所差异。在所有处理组中，Kn（7.5 μM）+
愈伤组织诱导与芽的再生
本研究成功开发出一种高效的无性繁殖方法，用于培育这种具有重要药用价值的积雪草。此前已有不少研究者报道过积雪草的直接和间接再生方法（Mohapatra等人，2008；Naidu等人，2010；Suryakala等人，2014）。Naidu等人（2010）发现，在添加了BAP和激动素的MS培养基上培养节段外植体时，每个节段可产生2到8个芽；而Karthikeyan等人（2009）则在2.0 mg L?1的BA浓度下，每个节段可产生15个芽。
结论
本研究成功建立了一种高效的积雪草间接再生方法，实现了稳定的愈伤组织介导的微繁殖。
研究表明，添加GA?、硫酸腺嘌呤以及谷氨酰胺等生长添加剂对于促进芽的正常增殖以及提升形态发育效果具有重要意义。
再生出的小植株在驯化过程中表现出良好的生理活力和较高的存活率，说明它们已经成功适应了离体培养环境。
在遗传方面
数据可用性
本研究所分析使用的数据均收录在论文正文中。
CRediT作者贡献说明
Irfan Bashir Ganie：负责撰写初稿。 Anwar Shahzad：负责研究构思。 Adla Wasi：负责正式数据分析。 Sabaha Tahseen：负责数据整理工作。
利益冲突声明
作者声明，就本篇论文的发表而言，不存在任何利益冲突。
