《Veterinary Medicine International》：Isolation and Identification of Pasteurella multocida From Bovine Respiratory Disease and the Effect of Baicalin on Its Drug Resistance
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本研究旨在阐明牛呼吸道多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）的耐药状况、耐药基因携带情况及黄芩苷对其耐药性的影响。研究人员从牛呼吸道疾病样本中分离培养菌株，随后进行聚合酶链反应（PCR）鉴定、药物敏感性试验及耐药基因检测。采用微量稀
本研究旨在阐明牛呼吸道多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）的耐药状况、耐药基因携带情况及黄芩苷对其耐药性的影响。研究人员从牛呼吸道疾病样本中分离培养菌株，随后进行聚合酶链反应（PCR）鉴定、药物敏感性试验及耐药基因检测。采用微量稀释法测定黄芩苷对Pm的最小抑菌浓度（MIC）。评估不同浓度黄芩苷对Pm耐药表型的影响，并采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测黄芩苷对aac(6′)-Ib-cr基因表达水平的影响。采用微孔棋盘稀释法测定黄芩苷与恩诺沙星联合作用的分数抑菌浓度（FIC），并比较喹诺酮类耐药决定区（QRDR）。共分离到10株Pm，包括8株荚膜A血清型和2株D血清型，其中5株为多重耐药株。所有10株均携带strA、strB和blaROB-1耐药基因。1/2 MIC和1/4 MIC浓度的黄芩苷随干预时间延长降低了Pm对阿米卡星、卡那霉素、环丙沙星和恩诺沙星的耐药性，并显著或极显著降低aac(6′)-Ib-cr耐药基因的表达水平。黄芩苷与恩诺沙星联用显示协同效应，联合培养后Pm中gyrA基因第83位异亮氨酸（Ile）被精氨酸（Arg）取代。分离的Pm菌株以A血清型为主且多为耐药株。黄芩苷可通过抑制aac(6′)-Ib-cr的表达，有效增强多重耐药分离株对阿米卡星、卡那霉素、环丙沙星和恩诺沙星的敏感性。黄芩苷与恩诺沙星联用表现出协同效应，相互增强细菌对药物的敏感性。
该研究发表于《Veterinary Medicine International》。牛呼吸道疾病（Bovine respiratory disease，BRD）是由细菌、病毒或混合感染及多种其他诱因引起的一大类疾病的总称，在全球广泛分布，是造成巨大经济损失的疾病之一，年损失超过10亿美元。其主要病原多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）属于巴氏杆菌科巴氏杆菌属，为革兰氏阴性、需氧或兼性厌氧、无运动力的两端钝圆球菌，病理材料经瑞氏染色或亚甲蓝染色呈两极浓染，有荚膜无鞭毛不形成芽孢，牛源Pm主要为A、B、E血清型，其中A血清型可导致牛纤维蛋白性肺炎，是引起BRD最主要的荚膜血清型。由于临床治疗中抗菌药物的不合理使用，越来越多多重耐药（Multidrug-resistant，MDR）Pm菌株被检出，在抗菌药物持续选择压力下耐药不断传播，使抗菌药物防控牛源Pm的疗效越来越差，严重威胁公共卫生安全并对养牛业构成重大隐患。黄芩苷作为中药黄芩的主要活性成分，不仅体现中药优势且作用较强，中药与抗菌药物联用可减少用量并增强疗效，但其对Pm耐药性调控的作用尚不清楚。因此研究人员从中国西北大规模牧场采集典型BRD症状样本，测定分离株耐药性并进一步探究黄芩苷对Pm耐药性的影响，为临床治疗MDR Pm所致BRD提供理论基础与用药指导，降低负面影响和经济损失，促进养牛业健康可持续发展。
研究人员主要从内蒙古、山西、甘肃等地区大规模牧场获取病死牛肺、肝等组织器官及54份有呼吸道症状牛的鼻拭子样本，开展Pm分离鉴定、体外药敏试验、耐药基因检测、黄芩苷对Pm耐药性影响评价、黄芩苷对抗性基因调控分析及黄芩苷与恩诺沙星体外联合药敏试验等关键研究。
3. Results
3.1. Isolation and Identification
研究人员从西北中国54份BRD病理样本中初步分离出共10株Pm，分离率18.5%，其中8株为A血清型Pm，2株为D血清型Pm，各地区病理样本菌株分离率显示甘肃鼻拭子分离率最高为54.5%。
3.2. Drug-Resistant Phenotypes
10株牛呼吸道Pm分离株中5株呈MDR趋势，占总分离株50%，具体分别为1株耐4类8种抗菌药物、1株耐4类6种、1株耐3类7种、2株耐3类5种，其余菌株耐药种类较少或无耐药。
3.3. Carriage of Resistance Genes
10株Pm分离株均普遍携带strA、strB和blaROB-1耐药基因，检出率100%；部分菌株携带其他耐药基因，检出率分别为qnrD 70%、aac(6′)-Ib-cr 60%、Sul1 50%、tetB 30%、qnrA 20%、qnrB 10%、tetH 10%，其余耐药基因未检出。
3.4. Resensitization Effect of Baicalin on Drug Resistance of Pm
3.4.1. Results of Baicalin MIC Determination
对6株MDR菌株评估黄芩苷MIC，Pm7为1.28 mg/mL，其余5株Pm2、Pm3、Pm4、Pm5、Pm8均为2.56 mg/mL，试验组阳性对照均浑浊，空白对照组澄清透明。
3.4.2. Resensitization Effect of Baicalin on Drug Resistance of Pm
不同浓度黄芩苷干预24、48、72 h后Pm药敏结果显示，黄芩苷对氨基糖苷类阿米卡星和卡那霉素的消敏效果显著优于喹诺酮类环丙沙星和恩诺沙星，干预24 h即对阿米卡星和卡那霉素耐药有良好消敏，72 h对环丙沙星和恩诺沙星有效消敏，其抗菌活性随药物浓度和培养时间增加而增加，呈浓度依赖性。
3.5. Regulation of Baicalin on Resistance Gene aac(6′)-Ib-cr
不同浓度黄芩苷处理后，抗性基因aac(6′)-Ib-cr表达水平随黄芩苷浓度升高和培养时间延长总体下降，1/2 MIC浓度黄芩苷干预72 h后显著下调aac(6′)-Ib-cr表达。
3.6. In Vitro Combined Antimicrobial Susceptibility Test
3.6.1. Results of Enrofloxacin MIC Determination
6株Pm菌株恩诺沙星MIC均≥0.5 μg/mL，Pm8最高为16 μg/mL，其余依次为Pm7为8 μg/mL、Pm3为4 μg/mL、Pm2、Pm4、Pm5均为0.5 μg/mL。
3.6.2. Determination of FIC Index for Baicalin Combined With Enrofloxacin
黄芩苷与恩诺沙星联用时，Pm2、Pm3、Pm4、Pm5、Pm7、Pm8分离株FIC指数均小于0.5，表明二者联用对这些菌株具有协同效应。
3.6.3. Effect of Baicalin Combined With Enrofloxacin on QRDR
联用干预前后QRDR基因碱基突变和氨基酸替换结果显示，Pm3分离株gyrA基因发生1个突变，碱基AUA248AGA突变，对应氨基酸由异亮氨酸替换为精氨酸（Ile83Arg），gyrB、parC、parE无突变。
讨论部分指出，本研究与既往埃及、加拿大等地研究一致，表明A血清型Pm流行与BRD相关。Pm耐药率逐渐上升，aac(6′)-Ib-cr等耐药基因可能与可移动遗传元件相关并水平转移传播，其具体基因组背景尚需研究，黄芩苷下调aac(6′)-Ib-cr表达的分子机制尚不明确，可能通过干扰应激反应、改变膜通透性或直接结合转录调节因子实现，黄酮类化合物可破坏膜完整性并影响全局基因表达，但直接结合调节因子尚未证实，需后续电泳迁移率变动分析（EMSA）和表面等离子共振（SPR）研究。本研究证实黄芩苷可有效逆转Pm对阿米卡星、卡那霉素、环丙沙星、恩诺沙星的耐药，其消敏效应可能与抑制氨基糖苷类和喹诺酮类修饰酶有关，黄芩苷抑制aac(6′)-Ib-cr表达减少乙酰转移酶产生从而降低抗生素灭活活性、增强敏感性，与既往黄芩苷联用环丙沙星对耐药金黄色葡萄球菌协同效应结果一致。黄芩苷可能通过破坏细菌膜完整性、增加通透性及干扰胞内稳态影响基因表达，也可能抑制细菌外排泵活性增加胞内抗生素蓄积，其确切分子靶点需结合直接结合实验和外排活性测定阐明。既往恩诺沙星诱导Pm耐药常伴gyrA的Ser83Ile等突变介导喹诺酮耐药，而本研究中Pm3的gyrA第83位Ile替换为Arg反而恢复对恩诺沙星敏感性，MIC从4降至0.25 μg/mL，高水平氟喹诺酮耐药通常需gyrA、gyrB、parC或parE多位点突变累积，单突变效应有限，本研究未检出parC等其他QRDR突变可能部分解释该分离株MIC相对较低。本研究主要评估黄芩苷体外抗菌及逆转耐药活性，其在食用动物临床转化仍面临生物利用度低、代谢快等挑战，黄芩苷口服生物利用度低且在体内迅速代谢为黄芩素和葡糖醛酸结合物，难以达到有效浓度，纳米递送系统和吸入制剂可增强黄酮类在呼吸道疾病中的稳定性和组织分布，雾化给药可直接递送至肺部绕过胃肠代谢提高局部疗效，黄芩素脂溶性更高膜通透性更强，可能比黄芩苷具更优生物利用度和抗菌效价，未来可开发为犊牛BRD饲料添加剂或吸入制剂，本研究仅关注黄芩苷处理后aac(6′)-Ib-cr表达，其他检出基因如qnrD、Sul1、tetB的黄芩苷调控作用尚需后续研究。
结论部分译为：本研究共分离10株Pm，主要表现对阿米卡星、卡那霉素、环丙沙星和恩诺沙星的多重耐药，分离株氨基糖苷类和喹诺酮类耐药基因携带率高，药敏试验结果与耐药基因携带有一定相关性。1/2 MIC和1/4 MIC黄芩苷显著降低aac(6′)-Ib-cr耐药基因表达，抑制Pm对上述药物耐药，使6株全部恢复对阿米卡星和卡那霉素敏感性，5株恢复对环丙沙星和恩诺沙星敏感性。黄芩苷与恩诺沙星联用对Pm具协同效应，通过诱导gyrA基因第83位Ile替换为Arg83增强恩诺沙星敏感性。
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