基于群体感应驱动的核黄素(QS-driven riboflavin)高产电活性细菌用于污泥强化生物发电：从模块优化到工艺性能

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Quorum sensing-driven riboflavin-hyperproducing electroactive bacteria for enhanced bioelectricity generation from sludge: From modular optimization to process performance

　　

废弃活性污泥(Waste Activated Sludge, WAS)是废水处理的显著副产物及生物能源的可再生资源。生物电化学系统(Bioelectrochemical Systems, BESs)将微生物代谢与电化学过程耦合，可直接将WAS中的有机物转化为电能。然而，其性能常受限于电活性细菌(Electroactive Bacteria, EAB)有限的胞外电子传递(Extracellular Electron Transfer, EET)能力。为克服此限制，研究人员设计了一种群体感应(Quorum Sensing, QS)驱动的合成策略，以创建自我调节的核黄素(Riboflavin)高产奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)。通过工程化Esa群体感应(Esa Quorum-Sensing, EQS)回路以自主控制核黄素生物合成，结合启动子微调(Promoter tuning)和密码子优化(Codon optimization)，研究人员开发了菌株SQR2，该菌株在生物反应器条件下产生269.9 mg/L核黄素且不损害细菌生长。增强的核黄素产量显著提升了BES性能，电流密度和功率输出分别较对照组增加了22.2倍和11.6倍。在处理WAS的混合BES中，引入SQR2菌株进一步促进了发电，降低了电荷转移电阻，并选择性增强了电活性微生物类群。该研究展示了一种从遗传设计到工艺应用的、无需诱导剂(Scalable, inducer-free)的可扩展策略，强化了基于污泥的生物发电并支持了可持续的废水资源回收。

这篇发表在《Synthetic and Systems Biotechnology》的论文针对生物电化学系统处理废弃活性污泥过程中电活性细菌胞外电子传递效率受限的问题，开展了基于群体感应系统调控核黄素合成的工程菌构建与应用研究。当前生物电化学系统在污泥能源化回收中面临微生物固有电子传递路径调控不足、外源氧化还原介体成本高且不稳定、工程菌在复杂菌群中代谢负担重及竞争力弱等挑战。研究人员通过在奥奈达希瓦氏菌中构建Esa群体感应驱动的核黄素生物合成动态调控模块，结合启动子微调与密码子优化，获得了高产核黄素且生长稳定的工程菌株SQR2，验证了其在纯培养及污泥混合菌群生物电化学系统中显著提升电流密度、功率密度及降低界面阻抗的效果，并分析了其对微生物群落结构的定向调控作用，为实现无需外源添加剂的可持续废水能源回收提供了合成生物学与环境微生物学结合的自调节生物催化策略。

作者为开展研究用到的主要关键技术方法包括：基于Esa群体感应系统的基因回路设计与工程菌株构建技术，涉及动态与静态表达系统的对比构建；摇瓶及5 L发酵罐规模的核黄素产量与乳酸消耗定量分析；以单室微生物电解池(Microbial Electrolysis Cells, MECs)和双室微生物燃料电池(Microbial Fuel Cells, MFCs)为平台的电化学表征技术，包括电流密度、循环伏安法(Cyclic Voltammetry, CV)、电化学阻抗谱(Electrochemical Impedance Spectroscopy, EIS)及极化功率曲线测定；构建整合工程菌与合肥市政污水处理厂厌氧驯化污泥的混合型生物电化学系统并进行多周期运行评估；基于Illumina MiSeq平台的16 S rRNA高通量测序微生物群落分析；以及实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR)基因表达分析。

研究结果如下：

3.1. Enhancement of riboflavin biosynthesis via EQS-mediated dynamic regulation

研究人员构建了由EQS系统动态调控ribABCDE操纵子的工程菌株SQR1及组成型表达对照菌株SCR。研究发现SQR1在低细胞密度期抑制核黄素合成以优先生长，高密度期激活合成，24 h产量达23.04 mg/L，较野生型对照增加71.0倍，且缓解了组成型表达带来的代谢负担与生长抑制；乳酸消耗呈可控模式；ribA基因表达呈时间依赖性上调，验证了QS响应激活特性。

3.2. Fine-tuning of EQS regulatory circuit for enhanced responsiveness

研究人员利用化学诱导启动子araC-P_BAD和tetR-P_tetO调控esaI与esaR表达，证实其剂量依赖性；随后对esaI和esaR进行密码子优化显著提升荧光信号；进一步采用不同强度组成型启动子组合构建SQG系列菌株，其中携带密码子优化的SQG9表现出最优荧光强度，确立了最优自主调控架构。

3.3. Riboflavin production performance of the optimized strain

基于SQG9电路构建最终菌株SQR2，摇瓶培养36 h产核黄素27.56 mg/L，较SQR1提升15.36%；LB培养基中达187.34 mg/L；5 L生物反应器批次发酵72 h产量达269.86 mg/L，较野生型增加约39.0倍，且生长稳健，证明了在工业相关条件下的高产稳定性。

3.4. Bioelectrochemical characteristics of the engineered strains

在MECs中SQR2峰值电流密度达769.75 mA/m²，分别为对照、SCR、SQR1的22.2倍、5.4倍和1.8倍；CV显示阳极电流响应显著增强；EIS显示电荷转移电阻最低。MFCs中SQR2峰值电压282.71 mV，最大功率密度116.72 mW/m²，较对照提升11.6倍。证实原位高产核黄素改善了介体可用性及生物膜导电性。

3.5. Enhanced electricity generation in hybrid BESs

将SQR2接入含WAS的混合型BES，首周期峰值电压达745 mV，高于对照及CK、SCR组，多周期运行保持稳定最高输出；CV显示更高氧化还原电流及核黄素特征峰；阳极上清核黄素含量最高达145.46 μg/L；EIS阻抗最低；最大功率密度达0.92 W/m²，较未接种BES提升2.49倍。表明工程菌在复杂污泥系统中通过核黄素介导强化产电。

3.6. Microbial community analysis

高通量测序显示接种改变了群落结构，SQR2-BES中Bacteroidetes被抑制，Firmicutes相对丰度显著增加；Longilinea和Anaeromusa-Anaeroarcus显著富集；Pseudomonas和Aeromonas等产电菌OTU增加；SQR2在运行中保持 substantial abundance。表明核黄素过产促进电活性菌群招募富集，形成互利微环境强化EET网络。

讨论部分总结指出，将工程菌整合入WAS菌群是模块化且生态兼容的策略，工程菌作为功能增强模块而非主导物种发挥作用。长期定殖与稳定性是挑战，可通过增强生物膜形成、改造非原生碳源利用及采用无抗质粒或基因组整合技术解决。该模块化接种策略与环境生物技术新兴框架一致，SQR2驱动了关键类群选择性富集，与电活性伙伴通过代谢物交换协作，核黄素过产导致的互惠微环境强化了介导的EET网络。

结论部分翻译：

在本研究中，研究人员在奥奈达希瓦氏菌中构建了基于EQS的动态调控核黄素生物合成系统。密码子优化与启动子微调使工程核黄素高产菌株SQR2在生物反应器中产核黄素高达269.86 mg/L。黄素合成路径的动态控制减轻了早期代谢负担并增强了EET。SQR2-BES实现了更高的电流生成、更低的电荷转移电阻及更大的功率密度，同时在混合BES中促进了电活性及产黄素微生物群的富集。这些结果证明了将合成生物学与环境生物技术相结合，用于可持续能源与化学品生产中自调节高性能催化剂的潜力。