深度学习驱动的PET水解酶协同工程用于消费后PET解聚

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Deep Learning–driven synergistic engineering of PET hydrolase for post-consumer PET depolymerization

　　

聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）的酶促解聚为缓解日益严重的塑料污染问题提供了一条有前景的途径。然而，开发能够处理消费后PET的高效PET水解酶仍然是一项关键挑战。人工智能（AI）的最新进展为加速PET水解酶的酶工程提供了新的机遇。在此，研究人员报告了使用深度学习框架EITLEM-Kinetics对PET水解酶NI（ThcCut1-AICCG-H185N/F189I）进行系统性计算重设计。通过整合突变自由能约束与动力学参数预测，该框架能够同时优化催化活性和热稳定性。共鉴定出9个有益替换位点，并经实验验证，克服了活性-稳定性权衡。组合迭代产生了最优变体NI-E65K/H107Y/A2R/L33F（NI-KYRF），其对Gf-PET薄膜和一步预处理消费后PET（pc-PET粉末）的解聚活性分别提高了80%和90%，同时熔融温度（T_m）增加了2.61?°C。NI-KYRF的比活性为665 μmol_TPAeq h^?1 mg_enzyme^?1，相比代表性高性能PET水解酶ICCG和TurboPETase分别提高了2.0倍和1.48倍。NI-KYRF对各种消费后PET废物和聚酯塑料的解聚性能显著提升。在70?°C下，其在24小时内对pc-PET粉末实现了95.5%的解聚转化率，对未经处理的消费后PET薄膜转化率达80.1%，解聚效率相比亲本NI提高了2.1倍。此外，对聚酯塑料（包括PBAT和PBT）的活性增强表明其底物谱扩大。分子动力学模拟和结构分析揭示，这些突变通过协同机制增强了酶的性能。总体而言，本研究建立了一个基于EITLEM-Kinetics的深度学习引导的计算设计框架，并展示了其在工程化高性能PET水解酶中的有效性和广泛潜力。

**论文解读：深度学习驱动的PET水解酶协同工程用于消费后PET解聚**

**研究背景与问题**
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是全球产量最大的合成聚合物之一，约占全球聚合物产量的18%，预计到2050年将超过2.5亿吨。由于其优异的机械性能、光学透明性和加工性，PET广泛应用于纺织品和包装领域。然而，其固有的化学稳定性使PET高度抵抗自然降解，导致环境持续累积和生态风险。酶促解聚利用PET水解酶将PET水解为单体对苯二甲酸（TPA）和乙二醇（EG），实现闭环回收，被认为是一种有前景的解决方案。蛋白质工程已发现并设计了高效PET水解酶变体（如ICCG），显著提高了解聚效率。然而，传统理性设计严重依赖详细的结构-功能关系和高品质结构数据，常受限于序列空间巨大、筛选通量低以及准确预测突变效应的挑战。此外，传统方法主要针对活性位点残基，通常忽略远端功能位点，且常面临催化活性与热稳定性之间的权衡。PET水解酶通常需要接近PET玻璃化转变温度（约70?°C）的反应温度以实现高效解聚，因此这一挑战尤为关键。尽管分子动力学和多尺度模拟可提供机制见解，但不适用于高通量突变筛选。人工智能（AI）的最新进展克服了传统结构生物学的关键限制，通过高效探索庞大的蛋白质序列空间加速了定制功能酶的设计。然而，现有AI辅助PET水解酶工程策略主要依赖结构卷积神经网络、分子动力学辅助机器学习、蛋白质语言模型和基于Transformer的进化模型，大多不直接预测突变依赖的催化动力学，而这是定量评估PET水解酶变体解聚效率的关键步骤。此前，研究人员开发了基于集成迭代迁移学习策略的深度学习模型EITLEM-Kinetics，实现了对酶变体动力学参数的高效预测。本研究应用该框架重新设计已工程化的PET水解酶变体NI，增强其对消费后PET的解聚性能。

**研究内容与结论**
研究人员采用深度学习框架EITLEM-Kinetics，结合突变自由能约束与动力学参数预测，对PET水解酶NI进行系统性计算重设计。通过进化保守性分析、蛋白质语言模型残基概率和结构上下文指导，鉴定出16个候选替换位点。经实验验证，其中9个突变显著提升了酶的性能，克服了活性-稳定性权衡。通过迭代组合，获得最优变体NI-E65K/H107Y/A2R/L33F（NI-KYRF）。该变体对Gf-PET薄膜和pc-PET粉末的解聚活性分别提高80%和90%，熔融温度（T_m）增加2.61?°C。比活性为665 μmol_TPAeq h^?1 mg_enzyme^?1，分别是ICCG和TurboPETase的2.0倍和1.48倍。对多种消费后PET废物（包括高结晶度PET）和聚酯塑料（PBAT、PBT）的解聚性能显著提升。在70?°C、酶载量3 mg/g条件下，24小时内对pc-PET粉末实现95.5%转化率；对未经处理pc-PET薄膜，0.5 mg/g酶载量下24小时转化率达80.1%。分子动力学模拟和结构分析揭示突变通过稳定N端柔性环、重塑局部相互作用网络、增强表面静电势和疏水性等协同机制提升性能。该研究发表在《Synthetic and Systems Biotechnology》。

**关键技术方法**
本研究主要采用以下关键技术方法：
1. **深度学习框架EITLEM-Kinetics**：基于集成迭代迁移学习，以蛋白质语言模型ESM-1v进行序列嵌入，预测酶变体的动力学参数（如k_cat、K_M）。
2. **FoldX自由能计算**：计算折叠自由能变化（ΔΔG），评估突变对热稳定性的影响，并设定按二级结构类别的能量阈值。
3. **分子动力学（MD）模拟**：使用AlphaFold3预测结构，在GROMACS中运行100 ns三重重复模拟，分析RMSD、RMSF及相互作用模式。
4. **静电势与疏水性分析**：采用APBS计算表面静电势，ProtScale（Kyte-Doolittle标度）评估疏水性变化。

**研究结果**
**3.1 深度学习框架引导的有益替换鉴定与迭代组合**
通过EITLEM-Kinetics结合FoldX稳定性过滤，从NI出发，对122个候选位点进行虚拟筛选，获得16个候选替换。实验验证其中10个突变提升解聚活性，9个同时提升活性与热稳定性，命中率56%。选择6个有益单突变（E65K、D86N、L33F、H107Y、A2R、Y222F）进行迭代组合。从最优单突变E65K开始，逐步构建双、三、四重突变体。其中，四重突变体NI-E65K/H107Y/A2R/L33F（NI-KYRF）在Gf-PET薄膜上活性提升80%，T_m增加2.61?°C；在pc-PET粉末上活性提升90%，被确定为最优变体。

**3.2 最优变体的PET解聚性能**
在标准化条件下（6 g/L底物、0.5 mg/g酶载量、70?°C），NI-KYRF比活性为665 μmol_TPAeq h^?1 mg_enzyme^?1，是ICCG的2.0倍、TurboPETase的1.48倍。对pc-PET粉末，NI-KYRF活性分别是ICCG和TurboPETase的1.27倍和1.39倍，单体TPA比例分别高1.75倍和1.98倍。对未经处理pc-PET薄膜，NI-KYRF活性也优于二者。在2 mg/g酶载量下，NI-KYRF对pc-PET粉末24小时转化率82.5%；3 mg/g时达95.5%。对未经处理pc-PET薄膜，0.3 mg/g酶载量下24小时转化率75.2%（NI的2.1倍），0.5 mg/g时达80.1%。对高结晶度PET薄膜，TPA释放量较NI提高35.4%。对PBAT和PBT，TPA释放量分别增加19.8%和52.2%，表明底物谱扩大。

**3.3 工程化变体性能增强的分子基础**
MD模拟显示，NI-KYRF的RMSD更低且更稳定，RMSF普遍降低，尤其在A2R、L33F和H107Y周围区域。结构分析表明所有突变位于表面，远离催化中心（S131-H209-D177）。A2R在N端环区与Glu6形成盐桥，稳定该柔性区域。E65K减少与T42、T84的氢键，但与邻近Asp86形成新盐桥，平衡局部柔性与刚性。L33F用Phe替换，降低环区柔性。H107Y增加表面疏水性。静电势计算显示A2R和E65K引入正电荷，增强表面正电位，有利于吸附PET表面。这些突变通过协同机制（稳定柔性环、重塑相互作用网络、增强表面静电和疏水性）共同提升酶的性能。

**总结讨论部分**
讨论部分指出，本研究建立的EITLEM-Kinetics框架通过直接整合蛋白质序列与底物分子表示，预测突变相关的动力学效应，并结合FoldX稳定性过滤，在统一计算框架内实现催化活性和热稳定性的同步优化。与传统AI辅助策略不同，该框架直接预测动力学参数，有助于定量评估解聚效率。通过鉴定N端柔性环中的有益突变，展示了其发现传统理性设计常忽略的远端功能位点的能力。最优变体NI-KYRF在多种消费后PET废物和聚酯塑料上表现出显著提升的解聚性能和热稳定性，在高温操作条件下具有优势。酶载量对解聚效率影响显著，降低酶用量需进一步提高内在催化效率和热稳定性，未来还需工艺优化和技术经济分析以平衡酶用量、解聚效率和经济可行性。分子机制揭示了多个突变通过协同作用优化酶的结构稳定性和底物结合。

**结论部分翻译**
在本研究中，研究人员使用深度学习框架EITLEM-Kinetics系统性地重新设计了PET水解酶NI，并获得了变体NI-KYRF（NI-E65K/H107Y/A2R/L33F），其催化活性和热稳定性协同增强。通过引入突变自由能预测，该框架能够同时优化动力学性能和结构稳定性。在16个预测的突变中，9个替换带来了显著的性能提升，有效克服了常规的活性-稳定性权衡。优化变体NI-KYRF在多种PET底物上的解聚性能大幅提升，对Gf-PET薄膜和pc-PET粉末的活性分别提高80%和90%，熔融温度增加2.61?°C。其比活性为665 μmol_TPAeq h^?1 mg_enzyme^?1，优于ICCG和TurboPETase。在70?°C下，NI-KYRF在24小时内对未经处理的消费后PET实现80.1%解聚，对pc-PET粉末转化率达95.5%。此外，对包括PBAT和PBT在内的其他聚酯的活性增强表明其底物谱扩大。分子动力学模拟和结构分析揭示，这些突变通过协同机制增强酶性能，包括稳定N端柔性环、重组局部相互作用网络、调节表面静电势和增加表面疏水性。值得注意的是，EITLEM-Kinetics引导的设计在识别N端无序环区域中的功能性相关突变方面表现出强大能力。总体而言，这项工作建立了一种深度学习驱动的酶设计策略，整合了动力学预测与能量约束，实现了活性和稳定性的协同优化。该框架为工程化高性能PET水解酶提供了一种有前景且可能具有普适性的方法。