聚苯乙烯纳米塑料损害气液界面培养的人支气管细胞的上皮屏障建立并调节细胞外囊泡释放

《Toxicologie Analytique et Clinique》：Polystyrene nanoplastics impair epithelial barrier establishment and modulate extracellular vesicle release in human bronchial cells cultured at the air-liquid interface

　　

塑料产量的不断增加导致微塑料和纳米塑料（MNPLs）对环境造成广泛污染，引发人们对其对人类呼吸健康潜在影响的日益关注。其中，纳米塑料（NPs）可深入肺部。然而，它们对人支气管上皮细胞的影响仍缺乏充分表征。在此，研究人员评估了40 nm聚苯乙烯（PS）纳米塑料（PS-NPs）在气液界面（ALI）培养的人支气管Calu-3细胞早期上皮建立阶段的影响，该三维模型代表功能上不成熟或受损的气道上皮屏障。慢性暴露（120 h）于PS-NPs（12和120 μg/cm²）以浓度和时间依赖性方式干扰屏障建立，表现为跨上皮电阻（TEER）降低以及连接蛋白E-钙黏蛋白和闭锁小带蛋白-1（ZO-1）表达下降。PS-NPs还促进了多种炎症介质的释放，其中骨桥蛋白（OPN，公认的空气污染暴露生物标志物）以及IL-2和IL-10在两个上皮腔室中均表现出最一致的升高。其他细胞因子呈现浓度和腔室依赖性分泌模式。这种极化分泌模式提示上皮信号通路的选择性激活以及向黏膜下环境的旁分泌通讯。此外，PS-NPs被Calu-3细胞内化并包装进细胞外囊泡（EVs）中，这一过程可能限制急性细胞损伤，同时可能促进NP诱导信号的传播。总体而言，这些发现表明，在模拟受损气道上皮的条件下，PS-NP暴露会扰乱上皮屏障功能和极化细胞间通讯，提示NPs作为预先存在上皮功能障碍的加重因素的机制作用。

**研究背景与意义**：全球塑料产量持续增长，导致微塑料和纳米塑料（MNPLs）在环境中广泛累积，其中纳米塑料（NPs）因尺寸小可深入下呼吸道并穿透支气管和肺泡上皮屏障。已有研究将高浓度NP暴露与哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺纤维化及肿瘤等呼吸系统疾病的发生或恶化相关联。然而，目前多数体外研究依赖浸没式单层培养模型，无法准确模拟气道上皮的结构与功能复杂性。为此，研究人员采用气液界面（ALI）培养的人支气管腺癌细胞Calu-3，建立三维模型，该模型在培养第2天代表功能不成熟或受损的气道上皮屏障，第7天则接近成熟极化状态。该研究旨在探讨聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPs）在早期屏障建立阶段对上皮细胞活力、屏障完整性、细胞因子分泌及细胞外囊泡（EVs）介导通讯的影响，为揭示NPs作为既有上皮功能障碍加重因素的机制提供依据。论文发表在《Toxicologie Analytique et Clinique》。

**主要技术方法**：研究人员使用动态光散射（DLS）和电泳光散射表征PS-NPs（40 nm）的水动力学直径、多分散性指数（PDI）和ζ电位。基于Calu-3细胞系（ATCC，HTB-55）建立ALI培养模型，在屏障建立阶段（第2至第7天）进行120 h慢性暴露。通过乳酸脱氢酶（LDH）释放评估细胞损伤，跨上皮电阻（TEER）监测屏障完整性，激光共聚焦显微镜（CLSM）和Western blot检测E-钙黏蛋白和闭锁小带蛋白-1（ZO-1）的表达与定位。采用半定量细胞因子抗体阵列（80种蛋白）和定量ELISA/Luminex多重检测分析炎症介质，结合Ingenuity Pathway Analysis（IPA）进行通路富集。通过流式细胞术和CLSM评估EVs浓度及PS-NP内化与包装，透射电镜（TEM）确认EV形态。

**研究结果**：
**3.1 PS-NPs的物理化学表征**：DLS显示PS-NPs在储存液和PBS稀释液中均呈单峰分布，水动力学直径约43–45 nm，PDI低，ζ电位为负值，表明在实验条件下保持稳定胶体行为，无显著聚集。
**3.2 PS-NP暴露对上皮屏障建立的影响**：TEER测定显示，12和120 μg/cm² PS-NPs暴露48 h后显著降低TEER值，呈浓度和时间依赖性，表明屏障建立受损。CLSM和Western blot证实，PS-NPs导致E-钙黏蛋白和ZO-1荧光强度下降、细胞间连接分布紊乱，蛋白表达水平降低，提示旁细胞通透性增加。
**3.3 探索性细胞因子谱分析**：半定量抗体阵列（120 μg/cm²）揭示，22种（顶侧）和36种（基底侧）细胞因子变化超过1.5倍，多数上调。骨桥蛋白（OPN）、IL-2和IL-10在两侧腔室均显著升高，而ENA-78和TGFβ-2呈现腔室特异性差异。IPA分析预测OPN、脂多糖（LPS）和香烟烟雾为上游调控因子，富集炎症相关通路如病原体诱导的细胞因子风暴和IL-17信号通路。
**3.4 细胞因子分泌的定量评估**：ELISA和Luminex定量验证显示，OPN、IL-2、IL-10在顶侧和基底侧均显著增加（两种浓度），CXCL8、IL-1β、IFN-γ在顶侧升高，ENA-78、TIMP-1、CCL2在基底侧仅在120 μg/cm²时升高，提示浓度和腔室依赖的分泌模式。
**3.5 PS-NP内化与EV释放**：CLSM显示Dragon绿色标记的PS-NPs被Calu-3细胞高效内化，呈核周分布且浓度依赖性增强。流式细胞术检测发现，顶侧EVs（CD63⁺/FLOT-1⁺）数量在120 μg/cm²暴露后显著增加，基底侧无显著变化。CLSM和TEM证实EVs内包裹PS-NPs，流式细胞术确认EVs携带绿色荧光，表明NPs被包装入分泌的囊泡中。

**讨论与结论**：研究人员指出，PS-NP慢性暴露在早期ALI培养的Calu-3细胞中干扰了上皮屏障建立，降低了TEER并下调E-钙黏蛋白和ZO-1，这与上皮屏障理论一致，即环境屏障破坏因子促进炎症疾病发展。细胞因子谱显示OPN、IL-2、IL-10的持续升高，其中OPN是空气污染暴露的生物标志物，与慢性气道疾病相关，提示PS-NP激活了类似环境应激的信号通路。EVs中包裹NPs可能作为限毒机制，但同时也可能通过携带炎症介质和损伤相关分子模式（DAMPs）传播NP诱导的信号。研究局限性包括使用单一细胞系、缺乏免疫细胞组分、未评估成熟上皮及商用颗粒不完全代表环境NPs。**结论**：慢性暴露于40 nm PS-NPs在ALI培养的Calu-3细胞屏障建立阶段诱导结构性和功能性改变，导致屏障脆弱性增加，包括屏障形成受损和选择性、腔室依赖的炎症信号。此外，PS-NP暴露增加了顶侧EV释放并促进NPs包装入分泌囊泡。这些发现将EV释放识别为NP摄取与上皮信号改变之间的潜在机制联系，未来需研究EV分子货物及NP诱导的EV信号对气道通讯的影响。