通过生物信息学分析鉴定胶原三螺旋重复含1（Collagen triple helix repeat containing 1，CTHRC1）作为食管鳞状细胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma，ESCC）潜在预后生物标志物

《Translational Oncology》：Identification of CTHRC1 as a Potential Prognostic Biomarker in Esophageal Squamous Cell Carcinoma by Bioinformatics Analysis

　　

背景：食管鳞状细胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma，ESCC）是胃肠道恶性肿瘤中病死率最高的疾病之一，部分原因在于缺乏经分子验证的预后指标。胶原三螺旋重复含1（Collagen triple helix repeat containing 1，CTHRC1）是一种分泌性糖蛋白，在多种肿瘤类型的基质重塑中被涉及，但在ESCC中尚未得到系统性研究。本研究旨在通过多层次生物信息学框架明确CTHRC1在ESCC中的预后相关性。方法：利用TCGA-ESCA项目及两个独立GEO队列（GSE53624、GSE23400）的转录组谱量化CTHRC1相对于正常食管黏膜的丰度。应用加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）和蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein interaction，PPI）图谱描绘以CTHRC1为中心的功能模块和分子互作枢纽。分析GSE160269的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）数据以解析CTHRC1在肿瘤生态系统内的细胞类型特异性分布。通过Kaplan-Meier生存曲线、Cox回归和时间依赖性ROC分析评估预后相关性。通过在ESCC细胞系（EC109、KYSE-150、KYSE-30、TE-1）和原发癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）中进行qRT-PCR和免疫荧光（immunofluorescence，IF）获得实验佐证，并在KYSE-30中进行CTHRC1功能丧失和功能获得操作。结果：在所有三个基因组队列中，肿瘤组织的CTHRC1转录本较匹配正常组织显著升高（p < 0.001）。WGCNA将CTHRC1归入富集于细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）组织、上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）和侵袭信号的基因模块，而PPI图谱揭示其与胶原家族成员和基质金属蛋白酶的功能联系。单细胞分析将CTHRC1峰值活性定位于癌相关成纤维细胞和特定恶性上皮细胞亚群。临床上，CTHRC1升高与更高的T和N分期及晚期病理分期相关；高表达者面临显著更差的总生存期（多变量校正风险比 = 1.78，95% CI：1.23–2.57，p = 0.002），多变量Cox分析确认其独立于常规分期参数。体外实验中，qRT-PCR显示所有4种ESCC细胞系中CTHRC1 mRNA较HEEC富集4.8–8.5倍（p < 0.001）。IF实验证明CTHRC1在癌内与Pan-CK共定位，CTHRC1依赖性地调节Vimentin和MMP9丰度，并在肌成纤维细胞样CAFs中选择性与α-SMA共表达。结论：整合多组学分析提名CTHRC1作为ESCC中可重现过表达、临床可操作的预后分子。其与ECM重塑通路、肿瘤-间质串扰和不良生存结局的紧密耦合，使CTHRC1成为风险分层算法和靶向治疗开发的候选分子。前瞻性的多中心验证和体内机制剖析仍是迈向临床转化的必要下一步。

论文解读文章：

研究背景方面，食管恶性肿瘤在全球癌症相关死亡中排第六位，其中食管鳞状细胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma，ESCC）约占90%，在东亚人群中存在明显地理聚集。尽管采用了包括切除、化疗、放疗及分子靶向在内的多模式治疗，ESCC长期预后仍很差，多数登记处五年生存率低于20%。主要决定因素包括临床发现晚、倾向于淋巴血管播散以及缺乏验证过的预后和预测性分子标志物。高通量基因组和转录组分析虽揭示了ESCC背后的分子多样性，但将这些发现转化为具有明确临床效用的生物标志物十分困难。现行分期框架高度依赖解剖病理特征，常无法捕捉患者间生物学差异或个体层面治疗反应预测。胶原三螺旋重复含1（Collagen triple helix repeat containing 1，CTHRC1）编码一种最初被表征为血管损伤反应和动脉组织重塑介质的分泌性糖蛋白，在多种实体瘤中与ECM重组、细胞运动和基质侵袭相关，并与经典和非经典Wnt信号级联有关，但在ESCC中尚缺乏对其表达动力学、功能基因网络和独立预后效用的系统表征，因此研究人员开展了此项整合生物信息学研究。

研究人员利用TCGA-ESCA、GSE53624、GSE23400及scRNA-seq数据GSE160269，通过差异表达分析、加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）、蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein interaction，PPI）网络、单细胞解析、生存建模及体外细胞实验，综合探讨CTHRC1在ESCC中的表达、功能模块、细胞定位、免疫微环境关联及预后价值，最终得出CTHRC1是ESCC中可靠预后生物标志物和可靶向分子的结论，这对改进ESCC风险分层和靶向治疗开发具有重要意义。该研究发表于《Translational Oncology》。

作者为开展研究用到的主要关键技术方法与样本队列包括：从TCGA-ESCA项目获取185例肿瘤和13例正常食管组织RNA-seq谱，从GEO获取GSE53624（119例ESCC肿瘤样本）和GSE23400作为外部验证队列，从GSE160269获取单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）数据GSM8422228；采用Student t检验与Benjamini-Hochberg校正进行差异表达分析，对TOP5000可变基因进行WGCNA以划分CTHRC1相关共表达模块并做GO与KEGG富集，将相关基因提交STRING数据库构建PPI网络并计算拓扑中心性，利用Scanpy处理scRNA-seq进行质控、降维、聚类和细胞类型注释，通过ESTIMATE类评分和免疫细胞特征集估算基质与免疫评分及免疫检查点关联，按中位表达将患者分为CTHRC1-High与Low组进行Kaplan-Meier生存分析、Cox回归和时间依赖性ROC评估，以及在ESCC细胞系和原发癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）中进行qRT-PCR、免疫荧光（immunofluorescence，IF）及CTHRC1敲减与过表达验证。

研究结果部分保留原文小标题并简述如下：

CTHRC1 is significantly upregulated in ESCC：通过对TCGA-ESCA队列185例肿瘤与13例正常标本的转录组分析，鉴定出1651个上调基因和575个下调基因，CTHRC1在肿瘤组织中显著过表达（log₂FC = 2.97，调整p = 7.10e-06），其表达随AJCC病理分期进展而升高，Stage IV最高，ROC分析AUC达0.945，密度分布和DEG排序均确认其在ESCC中为顶部上调基因，具备区分肿瘤与正常组织的诊断潜力。

Co-expression network and functional module analysis：在TCGA ESCC队列TOP5000可变基因中共表达分析识别出156个与CTHRC1显著相关的基因（|r| > 0.6，FDR < 0.001），形成紧密协同模块；GO生物学过程富集显示ECM组织、胶原纤维组装、细胞-基质黏附和上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT），KEGG富集显示PI3K-Akt、局灶黏附、ECM-受体相互作用和TGF-beta信号通路参与，模块-性状关联证实其与临床特征紧密联系。

PPI network construction and hub gene identification：将CTHRC1相关基因提交STRING构建含131节点1262边的PPI网络，按度中心性前10位hub基因为COL1A1、COL1A2、COL3A1、FN1、POSTN等，均为ECM结构或基质细胞蛋白；hub基因间广泛共表达且协调上调，CTHRC1与COL1A1、POSTN、SPARC、MMP2/MMP9有直接互作预测，GO与KEGG均富集于ECM组织和PI3K-Akt等促侵袭通路。

Single-cell transcriptomic profiling of CTHRC1：对EC08标本11409个单细胞分15簇并注释为上皮、成纤维、内皮、T细胞、B细胞、髓系和肥大细胞；CTHRC1在成纤维细胞中表达最高，上皮细胞中等，免疫细胞极低，UMAP特征投影显示其富集于成纤维细胞优势区；CTHRC1阳性与阴性成纤维细胞差异分析显示前者显著上调胶原和基质相关基因，从细胞分辨率确立CTHRC1主要来源于肿瘤微环境（Tumor Microenvironment，TME）中myCAF及部分恶性上皮。

CTHRC1 association with the tumor immune microenvironment：ESTIMATE分析显示CTHRC1-High组基质、免疫和综合评分更高；Spearman相关显示CTHRC1与多种免疫细胞丰度及免疫检查点基因PDCD1、CD274、CTLA4、TIGIT、LAG3等相关；CTHRC1-High组EMT、血管生成、TGF-beta、Wnt/β-catenin通路活性更高，表明CTHRC1不仅关联基质重塑也参与免疫抑制微环境构建。

Clinical association and prognostic significance of CTHRC1：CTHRC1表达随AJCC分期I–IV进展升高，T3–T4和N1–N3显著更高；Kaplan-Meier显示高表达组总生存期显著更差；单变量Cox中CTHRC1 HR > 1，多变量校正HR = 1.78（95% CI：1.23–2.57，p = 0.002），时间依赖性ROC在1、3、5年具判别力，死亡患者CTHRC1显著高于存活者，证实其为独立于分期参数的预后因子。

CTHRC1 mRNA expression is upregulated across multiple ESCC cell lines：qRT-PCR显示4种ESCC细胞系CTHRC1 mRNA较HEEC上调5.18–8.47倍（均p < 0.001），KYSE-30最高；三种siRNA有效敲减CTHRC1后迁移、侵袭、增殖下降，过表达则增强，Transwell定量与气泡图显示CTHRC1表达与侵袭评分强正相关（r = 0.998），在细胞水平验证其促侵袭功能。

Immunofluorescence confirms CTHRC1 protein expression co-localizes with pan-CK in ESCC epithelial cells：双通道IF显示HEEC弱CTHRC1信号但Pan-CK丰富，所有ESCC细胞系CTHRC1红信号显著增强且在KYSE-150和KYSE-30最明显，叠加图像示CTHRC1与Pan-CK在胞质共定位，证实CTHRC1蛋白过表达是ESCC上皮区室的癌特异性属性，与mRNA结果一致。

CTHRC1 positively regulates emt marker vimentin and invasion-associated MMP9 in ESCC cells：在HEEC、亲本KYSE-30、si-CTHRC1及OE-CTHRC1细胞中做CTHRC1与Vimentin、MMP9共染IF；亲本中CTHRC1与Vimentin共表达且胞质重叠，敲减后Vimentin荧光明显减弱，过表达则增强；MMP9染色呈同样双向调节，证实CTHRC1剂量依赖性地正向调控EMT和基质降解程序。

CTHRC1 is overexpressed in esophageal cancer cells and positively regulates EMT-associated proteins：IF显示正常肺成纤维细胞（NLF）基线CTHRC1和α-SMA，CAF显著共增强，KYSE-30最强CTHRC1伴α-SMA表达；Western blot确认KYSE-30相比HEEC显著升高CTHRC1、Vimentin、MMP9（均P < 0.001），敲减显著降低后两者，过表达进一步上调，表明CTHRC1通过正调Vimentin和MMP9促进EMT，在食管癌细胞侵袭转移中起致癌作用。

讨论部分总结：研究人员指出本研究通过多层生物信息学与实验证据确立CTHRC1在ESCC中一致过表达且具有独立预后价值，跨TCGA RNA-seq、GSE53624芯片、GSE23400芯片三队列重现增强推断信心，诊断AUC超0.85；WGCNA将其定位于ECM稳态、胶原生物合成和EMT模块，但属共表达而非因果，PI3K-Akt等通路提供机制假设待验证；PPI揭示以COL1A1等结构胶原为中心的hub架构，与MMP2/MMP9/MMP14互作为计算预测需实验确认；scRNA-seq显示CTHRC1富集于myCAF及部分恶性上皮，提示自分泌与旁分泌共同维持高CTHRC1微环境；CTHRC1与晚期T、N分期及分化差紧密相关，多变量Cox证实正交预后信息，校正HR1.78具临床意义，列线图C-index从0.698升至0.742；时间依赖性AUC随随访延长增至0.748反映其在晚期演化中作用；体外实验 corroborate 生物信息学预测，敲减/过表达调控Vimentin和MMP9；CTHRC1分泌特性利于抗体中和且正常组织受限，具可接受治疗指数，可同时干预ECM重塑、EMT、血管生成与间质串扰，血清检测可作液体活检方向；研究局限包括回顾性需前瞻验证、缺组织蛋白水平、机制因果待体内模型、scRNA-seq样本少及PPI物理互作未证；未来需多中心验证、基因工程小鼠与患者来源类器官机制剖析、评估其作为抗间质/免疫疗法分层标志物、开发靶向治疗及构建多标记预后面板。

研究结论部分原文翻译：整合多组学分析提名胶原三螺旋重复含1（Collagen triple helix repeat containing 1，CTHRC1）作为食管鳞状细胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma，ESCC）中可重现过表达、临床可操作的预后分子。其与细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）重塑通路、肿瘤-间质串扰和不良生存结局的紧密耦合，使CTHRC1成为风险分层算法和靶向治疗开发的候选分子。前瞻性的多中心验证和体内机制剖析仍是迈向临床转化的必要下一步。