《Journal of Analysis and Testing》：Towards Sustainable Bioanalysis: First Green-Validated Synchronous Fluorimetric Platform for Nano-Level Determination of Co-Administered Empagliflozin and Favipiravir across Various Matrices
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考虑到糖尿病患者感染COVID-19后可能面临更差的预后，一种同时使用恩格列净（EGF）控制血糖和法匹拉韦（FPV）抗病毒的治疗方案常被采用。为此，研究人员开发了一种超灵敏且环境可持续的荧光技术，用于在多种基质（药物制剂和加标生物体液）中同时测定EGF和FPV
考虑到糖尿病患者感染COVID-19后可能面临更差的预后，一种同时使用恩格列净（EGF）控制血糖和法匹拉韦（FPV）抗病毒的治疗方案常被采用。为此，研究人员开发了一种超灵敏且环境可持续的荧光技术，用于在多种基质（药物制剂和加标生物体液）中同时测定EGF和FPV。该技术通过利用分析物的内源性荧光并优化实验条件，实现了高灵敏度、选择性和重现性。EGF和FPV在乙醇中的内源性荧光分别在308 nm和424 nm处测量，激发波长分别为238 nm和243 nm。初步测试显示分析物的荧光光谱存在显著重叠，阻碍了直接定量。为解决此问题，研究人员采用Δλ为60 nm的同步荧光测量模式，使得EGF和FPV分别在305 nm和429 nm处直接测定。该技术可灵敏测量EGF（浓度范围30–900 ng/mL）和FPV（5–400 ng/mL）。该技术根据国际协调会议（ICH）和美国食品药品监督管理局（FDA）指南进行了验证，并使用多种指标（Eco-scale和AGREE）评估其与可持续分析化学原则的符合性，结果表明其符合公认的分析化学可持续性基准。这种高灵敏度、经过验证且环境可持续的EGF和FPV定量技术可为临床医生提供更全面的药物浓度和潜在药物相互作用分析数据，有助于在COVID-19糖尿病患者的治疗管理中做出更明智的决策。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
COVID-19糖尿病患者面临更高的重症和死亡风险，常需重症监护、机械通气和延长住院时间。高血糖水平、糖尿病相关并发症及炎症标志物升高是导致不良预后的关键因素。因此，联合使用抗糖尿病药物（如恩格列净，EGF）和抗COVID-19药物（如法匹拉韦，FPV）有望同时控制血糖和抑制病毒复制，从而改善患者结局。然而，目前尚无同时分析EGF和FPV的已验证生物分析方法。现有研究分别针对EGF或FPV进行了定量分析，但未涉及二者共存时的测定。为支持未来药代动力学和药效学研究，亟需一种高灵敏度、高选择性且符合绿色化学原则的方法，用于在药物制剂和生物基质中同时测定纳米级浓度的EGF和FPV。该研究发表于《Journal of Analysis and Testing》。
**研究内容与结论**
研究人员开发了一种超灵敏、环境可持续的同步荧光光谱（SFS）技术，用于在药物制剂和加标人血浆、尿液中同时定量EGF和FPV。该技术利用分析物的内源性荧光，通过优化实验条件（pH、缓冲液体积、表面活性剂、溶剂、Δλ等）实现了高选择性和灵敏度。在优化条件下，使用Δλ=60 nm的SFS模式可在305 nm（EGF）和429 nm（FPV）处获得清晰分辨的荧光信号。线性范围分别为30–900 ng/mL（EGF）和5–400 ng/mL（FPV），检测限低至纳克级。方法依据ICH和FDA指南进行了全面验证，包括线性、准确度、精密度、选择性、稳健性及稳定性。绿色性评估采用Eco-Scale（仅13个惩罚点）和AGREE工具（评分0.74），均优于现有方法。该技术成功应用于商品化片剂（Empaglimax?和Anviziram?）及加标人血浆和尿液中的分析，回收率良好，无基质干扰。统计比较显示与参考荧光方法无显著差异。该研究的重要意义在于：首次提供了同时测定共用药EGF和FPV的绿色生物分析方法，具有高灵敏度、低成本、操作简便等优势，为COVID-19糖尿病患者的治疗药物监测提供了可靠工具。
**主要关键技术方法**
研究人员采用同步荧光光谱（SFS）技术，以Δλ=60 nm实现重叠光谱的分离；使用Britton-Robinson缓冲液（pH 3.50）优化荧光信号；选择乙醇为稀释溶剂；通过蛋白沉淀（甲醇）和离心从生物基质（人血浆和尿液，样本来源于埃及国家血库和健康志愿者）中提取分析物；利用Eco-Scale和AGREE工具进行绿色性评估。
**研究结果**
**3.1 光谱特性**
初步荧光分析显示EGF和FPV在乙醇中的发射峰分别为308 nm和424 nm，但零阶发射光谱严重重叠。通过采用Δλ=60 nm的SFS模式，在305 nm（EGF）和429 nm（FPV）处获得清晰尖锐的同步荧光信号，实现了直接定量。
**3.2 实验条件优化**
- **pH和缓冲液体积**：在酸性介质（pH 3.5）中荧光信号最强，最佳缓冲液体积为1.50 mL。质子化作用增强了分子刚性和激发态寿命。
- **表面活性剂**：无表面活性剂条件下信号最强，SDS、CTAB、Tween-80、β-CD和CMC均未增强荧光。
- **溶剂**：乙醇产生最强荧光信号，因其良好的溶解能力和低空白读数。
- **波长间隔（Δλ）**：Δλ=60 nm获得最佳分辨率和信号强度，过低或过高均导致分辨率或灵敏度下降。
- **时间稳定性**：荧光信号在3小时内保持稳定。
**3.3 方法验证**
- **线性和范围**：EGF线性30–900 ng/mL，FPV线性5–400 ng/mL，相关系数r≥0.9997。内滤效应可忽略，光稳定性良好。
- **准确度和精密度**：低、中、高浓度的日内和日间RSD<2%，回收率满意。
- **选择性**：七种不同比例混合物的分析表明无相互干扰。
- **检测限和定量限**：LOD和LOQ证实纳克级灵敏度。
- **稳健性**：Δλ、pH、缓冲液体积微小变化不影响结果。
**4. 方法应用**
- **药物制剂**：Empaglimax?和Anviziram?中EGF和FPV的回收率良好，标准加入法确认无基质效应。
- **生物体液**：在加标人血浆和尿液中，EGF线性40–300 ng/mL，FPV线性10–250 ng/mL，LLOQ分别为40和10 ng/mL。准确度（偏差%）和精密度（CV%）均符合FDA接受标准。选择性测试无内源性干扰，常见共用药（二甲双胍、利格列汀）无干扰。稳定性测试（短期、冻融、长期冷冻）结果合格。基质效应和提取回收率均在可接受范围内。
**5. 统计分析**
t检验和F检验显示建议方法与参考荧光方法无统计学差异，证实其可靠性。
**6. 绿色性评估与方法比较**
Eco-Scale惩罚点仅13（优于参考方法的14–28），AGREE评分0.74（高于参考方法的0.59–0.73）。建议方法灵敏度更高，且能分析人尿液样本，而参考方法均未实现此应用。
**总结与结论**
该研究引入了一种创新的荧光技术，用于同时测定共用药恩格列净（EGF）和法匹拉韦（FPV），适用于COVID-19糖尿病患者的联合管理。该技术在药物制剂和生物体液中均表现出高准确度和精密度，即使存在干扰物质也能稳定工作。其临床相关的灵敏度支持可靠的患者监测，低成本使其适合资源有限的实验室。与使用有毒有机溶剂（如乙腈）且灵敏度低的现有方法相比，该技术可靠、超灵敏且环境友好（经两种评估工具验证）。SFS技术相比HPLC更快、更经济，避免了昂贵色谱柱和大量有机溶剂；相比UV-Vis光度法具有更高灵敏度和选择性。尽管在六份独立血浆和尿液样本中表现满意，但真实患者样本的病理变异性可能影响分析响应，且SFS仪器在某些实验室可能有限。未来研究将在获得伦理批准后扩展至真实患者样本。
