基于质谱的血清N-糖基化生物标志物分析用于肺癌快速检测

《Journal of Analysis and Testing》：Mass Spectrometry-Based Analysis of Serum N-glycan Biomarkers for Rapid Lung Cancer Detection

　　

血液血清是易于获取的样品，常用于筛查测定和早期疾病检测。蛋白质糖基化(N-糖基化)已在多种病理条件下被证实发生改变。在本研究中，研究人员使用两种不同的制备方案，通过基质辅助激光解吸电离(matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)质谱验证非小细胞与小细胞肺癌初诊患者血清样本的N-糖链(N-glycan)谱变化。在大多数患者（包括炎症患者）的血清样本中观察到带有2,3-和2,6-连接的N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid, NeuAc)残基的岩藻糖基化三天线及四天线唾液酸化糖链增加。对去唾液酸糖链池的分析揭示了额外四天线糖链的存在，以及涉及多个N-乙酰乳糖胺(N-acetyllactosamine)单元的糖链天线数(antennarity)和延伸的整体增加。在患者中，这些糖链携带二至四个岩藻糖(fucose)单元，主要仅连接于天线上；相比之下，对照样本表现为带有零或一个岩藻糖残基的多天线糖链，且岩藻糖均等连接于天线和壳二糖核心(chitobiose core)。同一患者的血清与肺肿瘤样本比较显示若干N-糖链呈负相关，且在三天线及更高天线结构中分支和岩藻糖基化异构变异存在差异。这支持血清糖链改变更多反映伴发现象(epiphenomenon)而非肿瘤内在过程的假说。尽管如此，血清中增加的天线岩藻糖基化和分支复杂多重岩藻糖基化糖链的存在可作为恶性筛查的可靠标志物，值得对这些患者进行进一步的临床评估。

研究背景方面，肺癌是全球高发恶性肿瘤，高死亡率主要归因于晚期诊断和疗效有限，且非吸烟人群患病比例上升，现有影像与分子诊断在早期检测上仍存挑战。蛋白质糖基化作为关键翻译后修饰，其N-糖链在癌症中呈现疾病特异性改变，包括天线数增加、分支异常、岩藻糖基化及唾液酸化变化，血清因微创且反映全身生理变化成为生物标志物发掘热点，基质辅助激光解吸电离质谱等技术可实现高灵敏检测，但既往研究在岩藻糖基化、去半乳糖基化等趋势上存在分歧，且血清与组织糖链关系尚未明确，因此研究人员开展本研究以系统剖析肺癌患者血清N-糖链谱，验证潜在筛查标志物并探讨其来源假说。

研究人员对111例肺癌患者（主要为非小细胞肺癌和小细胞肺癌）及41例健康志愿者的治疗前血清样本，采用两种制备策略结合MALDI质谱分析，发现患者血清中岩藻糖基化三天线及四天线唾液酸化糖链增加，去唾液酸后可见多天线多重岩藻糖基化结构且岩藻糖主要连于天线，同一患者血清与肿瘤组织糖链呈负相关且异构偏好相反，表明血清糖链改变更可能为全身伴发现象而非肿瘤直接分泌，但天线岩藻糖基化与分支复杂多重岩藻糖基化糖链仍可作为可靠恶性筛查标志物，具有重要意义，该研究发表于《Journal of Analysis and Testing》。

关键技术方法包括：样本队列来源于马萨里克大学医院呼吸病与结核科收治的111例经组织病理学确诊的肺癌患者（含非小细胞肺癌、小细胞肺癌及8例炎症）治疗前血清，及41例无恶性肿瘤史的健康志愿者血清，均经区域伦理委员会批准并个体分析不混合；采用两种制样策略，其一为血清N-糖链释放后甲基酯化联合靶点苯肼(phenylhydrazine, PHN)衍生化以保留并区分2,3-与2,6-连接的NeuAc，其二为血清先后经肽N-糖苷酶F(PNGase F)与产气荚膜梭菌神经氨酸酶(neuraminidase)处理获得去唾液酸中性糖链池；纯化分别用手制棉尖与石墨化碳固相萃取小柱；质谱分析使用UltrafleXtreme仪器正离子反射模式，FlexAnalysis平滑与基线校正，依据m/z与串联质谱碎片化解析结构；统计对强度log₂变换，随机森林、PCA、UMAP、t-SNE降维，去唾液酸池用加性对数比(additive log-ratio, ALR)以H5N4为参照，置换线性模型与Benjamini–Hochberg校正。

研究结果如下。

3.1 Patients and Serum Samples，研究人员分析111例患者（女38–82岁、男54–84岁，多吸烟）与41例对照（女28–63岁、男22–78岁，多非吸烟）血清，患者含非小细胞肺癌、小细胞肺癌及8例炎症，诊断依组织活检，样本治疗前采集存于?80 °C并个体分析。

3.2 N-Glycans of Cancerous Versus Healthy Serum Samples，研究人员用两种策略比较癌与健康血清N-糖链。

3.2.1 Comparative Analysis of Methyl Esterified Glycan Pools，研究人员在酯化池中检测85个峰（1300–4400 Da），患者中性糖占比低，高甘露糖型(H5-9N2)相对下降(p<0.01)，核心岩藻糖基化非半乳糖基化H3N4F1(m/z 1575.6)显著增加，半乳糖基化H5N4F1(m/z 1899.7)下降，含不同连接NeuAc的Se1Sp1H5N4F1(m/z 2585.97)增加；三天线至四天线唾液酸化糖链多岩藻糖基化且变化显著，如Se2Sp1H6N5F1(m/z 3256.222)、Se2Sp1H6N5F2(m/z 3402.28)升高(p<0.001)，Se2Sp1H7N6(m/z 3475.30)在对照更高；仅2,6-连接NeuAc从对照63%升至患者67%–69%，混合连接从4.8%升至6.4%，小细胞肺癌略高；PCA显示患者与对照沿PC1分离（17.9%），前十贡献糖链明确。

3.2.2 MS Analysis of Desialylated Serum Glycan Pools，研究人员在去唾液酸池检54峰（癌）与40峰（对照），高甘露糖与杂交型为minor峰，主导为H5N4(m/z 1753)，H3N4F1(m/z 1575)多数患者增加；三天线H6N5(m/z 2118)及其岩藻糖基化H6N5F1(m/z 2264.8)在癌中显著升高；患者具二至四岩藻糖的三、四及以上天线糖链（m/z 2410、2776、2922等）信号显著升高且在对照多低于检测限，对照偏好零或单岩藻糖（m/z 2483、2849等）；非与单岩藻糖基化在所有患者下降(p<0.001)，双岩藻糖在非小细胞与小细胞肺癌增加(p<0.003)，多于二岩藻糖显著升高；健康H6N5/H6N5F1比常>1.5，患者多<1；按特征汇总显示小细胞肺癌四及以上天线高于非小细胞肺癌。

3.2.3 Additional Structural Characteristics Linked to Malignancy and Correlated with Tumor Glycans，研究人员在串联质谱发现异构差异：癌中H5N4F1除核心岩藻糖外现天线岩藻糖异构（优选6-arm），对照仅核心；三天线H6N5F1在癌以3-arm分支且天线岩藻糖为主、核心异构少，对照均等，肺组织对照仅核心、肿瘤仅天线；更高天线H8N7F1在健康具核心与天线异构，健康肺组织仅核心，肿瘤仅天线且少；双岩藻糖四天线H7N6F2在血清以两岩藻糖均连天线为主；同一患者血清与组织比仅天线岩藻糖化增加相似，其余异构相反，支持血清改变非肿瘤内在过程。

讨论部分总结，研究人员此前EST-PHN可增强MALDI检测唾液酸化并区分连接，扩展至更大男女队列并比较去唾液酸谱，两法互补：酯化保留酸性与连接差异，去唾液酸显露四及以上多重岩藻糖化结构获结构信息；癌血清整体糖基化增加，高龄性别统计无清晰关系，多患者吸烟难排影响；高甘露糖在对照更高，与同患者癌组织增加相反；非半乳糖基化核心岩藻糖H3N4F1增加与文献一致，H5N4F1下降；三天线四天线唾液酸化在患者与炎症均升，与多癌种一致，2,6-连接NeuAc普遍增加且混合连接在患者略升；去唾液酸显示患者多天线二至四岩藻糖显著升高、对照零至一岩藻糖，选比值如H6N5/H6N5F1可作定性预测；分支岩藻糖化关联转移酶失调，组织随分期增多重岩藻糖化且核心与天线异构在组织肿瘤相反，血清仅双天线同组织趋势，三及以上天线异构相反，同患者多数组织特异未加工分支复杂岩藻糖化在血清未检，支持血清糖链反映宿主全身应答而非肿瘤直接脱落；局限为早期与亚型例数不均未细分，其他恶性肿瘤与更详细健康背景需后续研究。

结论部分翻译，总之，研究人员结果确认既往报道趋势：病变血清中三天线及四天线唾液酸化糖链增加，但按连接类型分类的总唾液酸化比例无非常显著差异，可能由岩藻糖基化状态解释，其在患者与对照呈相反趋势，这在去唾液酸池中更明显；患者中岩藻糖基化糖链明显增加，伴随对应多天线结构附加峰，携带二至四岩藻糖单元且主要连于天线；尽管同一患者血清与肺组织谱比较仅确认天线岩藻糖化增加相似，此改变可能代表致癌的一般标志之一；总体而言，结果表明N-糖链谱分析有望作为有前景的非侵入性诊断工具用于癌症筛查，在样品处理与谱图解读上，所示去唾液酸样本质谱分析更适于临床实施，可支持具特征糖链改变患者的进一步评估。