人细胞中NatB共翻译蛋白质N端乙酰化的结构基础

《Nature Communications》：Structural basis of cotranslational protein N-terminal acetylation by NatB in human cells

　　

共翻译N端乙酰化是一种广泛存在的修饰，塑造真核细胞中蛋白质的稳定性、定位与功能。必需的人NatB复合物（NAA25?NAA20）对相当一部分蛋白质组的起始甲硫氨酸进行乙酰化，然而NatB如何结合翻译中核糖体的机制尚不清楚。此处研究人员定义了NatB功能的共翻译机制。NatB被新生多肽相关复合物（NAC）通过其NACα UBA结构域与辅助亚基NAA25之间的高亲和力相互作用招募，同时两个NatB亚基与隧道出口附近的核糖体表面形成额外接触。这些相互作用共同将NatB活性位点定位于紧邻新生链出现的位置，从而实现对新合成蛋白质的高效修饰。结构比较揭示了与其他N-乙酰转移酶（包括NatA/E和NatD）共享的保守核糖体结合架构，意味着核糖体占据是相互排斥的。结合先前工作，这些发现确立了NAC作为共翻译N端加工的中央组织者。

研究背景方面，真核细胞中的蛋白质合成与共翻译N端加工紧密偶联，约80%–90%的胞质核蛋白经历不可逆的共翻译N端处理，包括甲硫氨酸氨基肽酶（MetAP）切除起始甲硫氨酸，以及N-乙酰转移酶（NAT）和N-豆蔻酰转移酶（NMT）分别催化N端乙酰化和豆蔻酰化。其中约40%的蛋白质经历两步途径，即甲硫氨酸切除后乙酰化或豆蔻酰化，其余则在起始甲硫氨酸上直接乙酰化。这些不可逆修饰深刻影响蛋白质稳定性、折叠、相互作用和膜关联，其紊乱与癌症及神经发育疾病相关。共翻译N端修饰必须在新生链从核糖体隧道露出且尚未折叠的短暂时间窗口内发生，多种共翻译酶如何在核糖体隧道出口处高效且无干扰地作用长期以来尚不明确。近期研究表明，两步N端加工途径由新生多肽相关复合物（NAC）协调，NAC通过柔性C端延伸招募MetAP1及下游NAT（NatA/E、NatD）或NMT，组织新生N端的顺序修饰。与此同时，大量新生蛋白需在起始甲硫氨酸上直接乙酰化，主要由NatB负责，NatB是由辅助亚基NAA25与催化亚基NAA20组成的异源二聚体，识别第二位为酸性或极性残基（D、E、N、Q）的底物，乙酰化约20%人类蛋白质组，包括肌动蛋白、原肌球蛋白、CDK2和α-突触核蛋白等，其致病性变异与发育迟缓、智力障碍和小头畸形相关。尽管NatB重要，但人NatB如何结合翻译中核糖体及其活性如何与NAC依赖的两步途径协调仍未知，因此开展本研究以阐明人NatB共翻译机制、核糖体招募方式及其与NAC和其他NAT在核糖体隧道出口的整合关系。本研究通过结构生物学与细胞功能实验，定义人NatB共翻译N端乙酰化的分子基础，确立NACα UBA结构域招募NatB，揭示NatB通过多价核糖体对接定位活性位点，发现NatB、NatA/E与NatD竞争共同核糖体停靠位点，提出NAC作为中央组织者动态扫描模型，成果发表于《Nature Communications》。

关键技术方法方面，研究人员使用体外纯化的人源NatB、NAC及各突变体，结合从HEK293T细胞来源或体外翻译系统制备的人核糖体及ANXA4停滞核糖体?新生链复合物（RNC^ANXA4），通过蔗糖垫超离沉降实验分析核糖体结合；利用siRNA敲低HEK293T细胞中NACα、NAA25、NAA20并回补突变体，检测核糖体关联与ANXA4?GFP?FLAG报告底物的N端乙酰化水平；采用单颗粒冷冻电镜（cryo?EM）解析RNC^ANXA4·NAC·NatB复合物结构至3.19 ?整体分辨率；借助AlphaFold建模NAC?NatB界面并设计定点突变验证；通过体外竞争结合实验评估NatB与NatA/E、NatD的互斥占据；所有体外与细胞内实验均设至少三个独立生物学重复。

研究结果部分，各小节内容及结论如下。

NAC promotes cotranslational Nt?acetylation of initiator methionines by NatB：研究人员通过体外核糖体结合实验发现，存在NAC时NatB能有效结合核糖体，缺失NAC则结合微弱；在HEK293T细胞中敲低NACα显著降低NatB的核糖体关联，同时ANXA4报告底物的N端乙酰化水平大幅下降，程度类似于敲低NAA25，表明NAC促进NatB在翻译核糖体的招募与起始甲硫氨酸的共翻译N端乙酰化。

Structure of the human NAC?NatB complex on translating ribosomes：研究人员利用cryo?EM解析了RNC^ANXA4与NAC及NatB复合物的3.19 ?结构，显示NAC与NatB同时结合于隧道出口区域，NACβ N端锚定于eL19和eL22位点，NAC球状域邻近隧道出口；NatB位于NAC球状域旁，NAA20催化中心朝向隧道出口，活性位点距隧道出口约50 ?，与MetAP1、NatD、NMT等早期作用酶几何相似，提示NatB在新生链达约50残基时即可进行共翻译加工。

Multivalent ribosome docking of NatB via NAA25 and NAA20：结构显示NatB通过辅助亚基NAA25的两个界面与核糖体RNA结合，一是C端保守碱性环（K871?K877）接触ES7a，二是N端TPR基序（K28、K36、K39、K40）接触28S rRNA螺旋H19和H24邻近uL24；催化亚基NAA20的C端环（E144、D146、H170）也接触5.8S rRNA与uL24。细胞中引入电荷反转或突变均削弱NatB核糖体结合与ANXA4乙酰化，其中TPR界面突变影响最严重，表明NatB通过辅助与催化亚基三处独立界面多价对接，区别于其他仅通过辅助亚基结合的NAT。

The NACα UBA domain recruits NatB to translating ribosomes：cryo?EM图中NAA25表面额外密度对应NACα UBA结构域，AlphaFold建模显示NACα UBA与NAA25 TPR形成静电与疏水相互作用；突变NACα（D205K、V207A/M211A、ΔUBA）或NAA25（R179D）均几乎完全破坏体外与细胞内NatB核糖体招募及报告底物乙酰化，确立NACα UBA结构域是NatB在翻译核糖体上的关键招募模块，且NACα UBA协调NatA/E、NatB与NatD至少四种NAT。

Comparison of ribosome interaction mechanisms of NatA/E, NatB, and NatD：比较显示三者结合隧道出口旁NAC球状域邻近重叠位点，均利用28S rRNA H19和H24作为共享停靠平台，并通过NACα UBA结构域招募；NatB与NatA/E的辅助亚基均接触ES7a，近出口处均通过TPR基本残基结合H19/H24，但NatB独有催化亚基NAA20近出口额外接触；NatD为单亚基酶，以短N端碱性螺旋结合H19/H24而不接触ES7a；三者细胞浓度不同且在体外可相互置换核糖体结合，暗示互斥占据与动态扫描；NACα UBA以类似疏水面招募不同NAT，V207参与所有界面，构成多功能适配器。

讨论部分总结，研究人员指出核糖体结合NatB的整体折叠与此前无核糖体结构相似，但核糖体结合状态解析了先前未明确的核糖体接触区；NatB由NAC主要通过NACα UBA与NAA25相互作用招募，辅以两亚基直接静电接触核糖体，定位于隧道旁以实现起始甲硫氨酸乙酰化。NatB、NatA/E与NatD虽底物不同但占据重叠核糖体位点、结合相同rRNA螺旋并依赖NACα UBA招募，暗示互斥占据与快速动态采样；特异性不由核糖体结合强制决定，而由酶活性口袋结构约束与第二位残基身份决定，NatB只乙酰化第二位为酸性或极性残基的起始甲硫氨酸，MetAP1不能切割第二位为大体积残基的底物，从而避免错误加工；MetAP1停靠位在NatB结合核糖体上可能仍可达，但对NatB底物无催化活性；NatA活性位点较远，允许NMT先访问以限制过早NatA乙酰化。NAC作为柔性支架维持高浓度酶云于隧道出口，通过其C端臂招募MetAP1、NMT1/2、NatA/E、NatB、NatD及伴侣CHP1/PBDC1与ER靶向因子SRP，建立动态而空间受限的微环境，确保新生链及时检查与加工，从随机扩散传统观点转向NAC组织的结构化细胞质微环境框架，统一理解共翻译途径在早期蛋白质合成的效率与特异性。

研究结论部分原文翻译为：本研究定义了人NatB共翻译N端乙酰化的分子基础，并将该途径定位于核糖体出口位点更广泛的组织框架内。核糖体结合NatB的整体折叠与先前确定的无核糖体NatB结构非常相似，无主要构象差异。然而，核糖体结合状态解析了关键区域——特别是介导核糖体接触的区域——这些区域先前未明确。研究人员显示NatB被NAC招募到翻译核糖体，主要通过NACα的UBA结构域与NatB辅助亚基NAA25之间的相互作用。结合两个NatB亚基与核糖体表面的直接静电接触，这种相互作用将NatB定位于核糖体隧道旁，使得起始甲硫氨酸在从核糖体出现时能够被有效乙酰化。将NatB招募机制与先前表征的NatA/E和NatD架构比较揭示出意外的收敛。尽管作用于不同底物，所有三种NAT占据重叠的核糖体结合位点，在隧道出口附近结合相同rRNA螺旋（H19和H24），并依赖NACα UBA结构域内共同疏水表面进行招募。这些相似性显著，因为NatB直接乙酰化起始甲硫氨酸，而NatA和NatD需要MetAP1先进行甲硫氨酸切除。尽管如此，共享的结合模式意味着NAT与核糖体的结合是相互排斥的，引发在如此拥挤环境中如何实现准确底物选择的问题。研究结果支持一个模型，即共翻译酶在链从隧道露出时快速瞬时采样新生链。特异性不在核糖体结合水平强制执行，而是由每个酶活性位点内的结构约束决定。对于NAT，起始甲硫氨酸后氨基酸的身份在决定新生N端是否能有效结合催化口袋中起决定性作用。例如，NatB仅当起始甲硫氨酸后跟随酸性或极性残基时才乙酰化起始甲硫氨酸，排除对 destined for 甲硫氨酸切除的底物修饰。相反，MetAP1不能切割第二位为大体积残基的起始甲硫氨酸，防止不当加工NatB底物。值得注意的是，MetAP1对接位点在NAC和NatB结合的核糖体上似乎仍可及，表明MetAP1可与这些复合物共占据，但对NatB底物保持催化无活性。因此，保真度由底物与酶活性位点的兼容性编码确保，允许多种酶检查同一新生链而无误加工风险。潜在例外是NatA原则上可在MetAP1切除甲硫氨酸后乙酰化NMT底物的N端甘氨酸，但NatA活性位点比其他酶包括NMT更远离隧道出口，这种空间排列允许NMT首先访问新生N端，从而限制过早NatA介导的乙酰化。这种快速核糖体采样要求修饰酶维持在核糖体隧道出口附近的高局部浓度。NAC似乎通过充当柔性支架发挥此作用。选择性核糖体谱分析显示，在新生N端出现时NAC几乎存在于所有核糖体上。通过其延伸的C端臂，NACα和NACβ招募广泛的共翻译酶，包括MetAP1、NMT1、NMT2、NatA/E、NatB和NatD。这些酶共同占人类细胞中几乎所有已知的N端加工事件。唯一核糖体结合机制及其对NAC潜在依赖性尚不清楚的酶是NatC，一种与NatE底物特异性重叠的三聚体复合物（NAA35、NAA30、NAA38）。除这些修饰酶外，先前研究表明NAC还通过其C端尾招募共翻译伴侣CHP1/PBDC1和ER靶向因子SRP。这种组织暗示从传统蛋白质生物发生因子通过随机扩散结合核糖体的观点转变。相反，NAC建立一个动态但在空间上受限的环境——一团修饰酶、伴侣和靶向因子在隧道出口随时待命——确保新生链的及时检查与加工。NAC建立的这种结构化细胞质微环境为理解共翻译途径如何在蛋白质生物发生最早阶段实现效率与特异性提供了统一框架。