评估昆虫病原真菌与根瘤菌共接种对植物生长及根系形态影响的方法学框架

《Plants》：Methodological Framework to Evaluate Entomopathogenic Fungi and Rhizobial Co-Inoculation Effects on Plant Growth and Root Morphology

　　

昆虫病原真菌（entomopathogenic fungi, EPF）日益被认为是具有多重功能的生物投入品（bioinputs），但仍需要稳健的方法学途径来评估其与既有微生物接种剂的相容性及其对植物表现的影响。本研究提出了一个综合性框架，用于评估大豆（Glycine max）中Metarhizium–Bradyrhizobium互作，结合了实验室相容性筛选与温室评价。首先，采用双培养测定（dual-culture assays），在可同时支持真菌与细菌伙伴生长的培养基中，将Metarhizium anisopliae LCM S04和Metarhizium brunneum LCM S11与Bradyrhizobium diazoefficiens BR 85（=SEMIA 5080）及Bradyrhizobium japonicum BR 86（=SEMIA 5079）进行检测，从而直接评价微生物间相容性。随后，在温室条件下通过种子直接接种对上述微生物在大豆中的效应进行评估。每粒种子分别接受细菌培养物、真菌悬浮液或二者共同处理（并设置绝对对照和施氮对照）。植株在受控条件下维持47 d。研究人员评估了株高、叶片形成、分枝、结瘤、生物量及根系形态。体外（in vitro）未观察到抑制带，共接种亦未损害结瘤。BR 86 + LCM S04组合提高了大豆细根数量。该框架为评估微生物相容性及功能性生物投入品效益提供了一种可重复的方法，并可适配于大豆以外的作物。

该文发表于《Plants》，核心目标是建立一套可重复、可推广的方法学框架，用于系统评价昆虫病原真菌（entomopathogenic fungi, EPF）与根瘤菌在作物中的相容性及共接种效应，并据此判断其是否能够在不破坏豆科植物—根瘤菌共生固氮体系的前提下，进一步促进植物生长和优化根系结构。研究背景在于，Metarhizium属真菌长期被视为农业生态系统中重要的昆虫病原微生物，但近年来越来越多证据表明，这类真菌还可作为根际定殖者、内生菌及植物促生微生物参与植物—土壤—昆虫三方互作。与此同时，大豆生产高度依赖Bradyrhizobium属细菌介导的生物固氮（biological nitrogen fixation, BNF）。然而，若要将EPF与根瘤菌联合开发为多功能微生物联合制剂，前提是两者之间不存在拮抗，且共接种后不能损害结瘤与植物表现。当前相关研究仍较少，尤其缺乏标准化的相容性评价流程，也缺少对根系形态结构变化的系统分析，因此开展本研究具有明确的方法学和应用价值。

研究人员围绕巴西大豆生产中具有代表性的两株根瘤菌——Bradyrhizobium diazoefficiens BR 85和Bradyrhizobium japonicum BR 86，以及两株土壤来源的Metarhizium菌株——Metarhizium anisopliae LCM S04和Metarhizium brunneum LCM S11，构建了“体外相容性筛选—温室植株评价—根系表型分析—基质中真菌回收验证”的连续研究框架。研究表明，所测试真菌与根瘤菌组合在体外条件下未出现抑制带或明显拮抗；在温室条件下，共接种未破坏大豆结瘤，说明根瘤菌—豆科共生关系得以维持；其中BR 86 + LCM S04在改善细根数量方面表现突出，提示特定组合可对根系构型产生附加效应。总体而言，该研究提出的方法不仅能筛选相容的微生物组合，还能进一步识别其对根系结构和植物生物量的功能性贡献，为热带农业可持续生物投入品开发提供了标准化路径。

就主要技术方法而言，研究采用四类关键手段：其一，利用PDA培养基上的双培养对峙试验，对Metarhizium与Bradyrhizobium进行体外相容性筛选，并以菌落径向生长和是否出现抑制带作为核心判据；其二，在温室内以大豆品种cv. Brasmax Olimpo IPRO为材料，设置未接种对照、施氮对照、单接种及共接种处理，通过种子直接接种开展47 d盆栽试验；其三，采用扫描成像结合WinRHIZO根系表型分析，对根长、表面积、体积、平均直径、分叉、交叉及不同直径等级根数进行定量；其四，于试验结束后通过选择性培养基对基质中Metarhizium进行回收与定性鉴定，以验证真菌在根际环境中的持续存在。

以下根据论文结果部分的小标题进行解读。

2.1. In Vitro Compatibility Test
该部分通过双培养体系评价真菌与细菌间是否存在直接拮抗。研究人员采用两项互补标准判定相容性：一是菌—菌界面不存在可见拮抗现象，如抑制带或生长受阻；二是真菌菌落在培养期内维持正常扩展。结果显示，所有Metarhizium—Bradyrhizobium组合均未观察到抑制带，也未出现明显拮抗迹象，说明所建立的PDA基础双培养系统能够同时支持双方生长并有效用于负互作筛查。进一步回归分析表明，培养时间对两株真菌菌落扩展均有显著影响。LCM S04与BR 85或BR 86共培养时，多数时间点菌落径向生长高于真菌单培养对照，提示某些组合可能存在促进效应；相较之下，LCM S11在双培养中的径向生长略低于单培养，但未形成抑制带，因此更接近轻度抑制而非真正拮抗。该结果说明，研究框架不仅可区分“相容/不相容”，还可识别中性、促进性及轻度抑制性互作模式。

2.2. Plant Inoculation Test
该部分通过温室接种试验检验体外判定为相容的组合在植株水平是否仍保持功能完整性，并评估其对大豆生长及结瘤的影响。

2.2.1. Plant Growth and Development
研究设置绝对对照（CTR）和施氮对照（NIT），同时纳入真菌单接种、根瘤菌单接种及共接种处理，以区分单一微生物效应和互作效应。株高、叶数、分枝数和地上部干物质被用作植株活力与营养生长指标。结果显示，含Bradyrhizobium的处理，无论单接种还是与Metarhizium共接种，其总体表现均优于未接种对照和真菌单接种处理。叶片数增加尤为明显，说明根瘤菌在促进植株营养生长方面具有主导作用，而单独施用LCM S04或LCM S11与CTR相比无显著差异。结瘤参数被作为判断相容性的关键生物学指标，因为理想的共接种体系不应削弱根瘤菌—豆科共生固氮。结果表明，结瘤仅出现在含Bradyrhizobium的处理之中，且所有共接种组均保持结瘤，证明真菌接种未破坏共生建立。部分组合，尤其BR 85 + LCM S04，其结瘤数量和瘤干物质相较根瘤菌单接种还有增强趋势。根干物质作为地下部生长与资源分配的综合指标，也表现出含Bradyrhizobium处理总体较高，其中BR 85 + LCM S04达到最高值。由此可见，该框架可同时完成相容性验证、结瘤保持评估和农艺功能筛选，而结瘤和生物量积累是最具信息量的初筛指标。

2.2.2. Effects on Root Morphology
该部分是本文的重要拓展，说明常规农艺性状之外，根系表型分析能够揭示更多微生物功能效应。研究人员通过图像化根系表型分析，对根长、表面积、平均直径、根体积等结构参数，以及总根数、分叉数、交叉数、细根、中根和粗根数量等构型参数进行测定。总体上，含Bradyrhizobium的处理根系发育优于未接种和真菌单接种处理，再次印证根瘤菌共生在大豆根系表现中的中心作用。更重要的是，一些特定共接种组合，特别是含M. anisopliae LCM S04的组合，在根系构型上呈现附加增益。例如BR 86 + LCM S04的根表面积最高，并显著高于CTR、真菌单接种处理及BR 86单接种。类似趋势还见于根长、总根数、分叉、交叉及细根数量等多个描述指标，说明共接种可改变根系复杂度和分枝模式，而这类效应不一定能从地上部性状或总生物量中直接观察到。论文据此强调，将根长、表面积、体积、总根数、分叉和根径等指标纳入评价体系，有助于更全面表征植物对微生物定殖的功能响应。尤其是BR 86 + LCM S04导致的细根增加，提示根系可能向更高吸收能力的方向重构。

2.2.3. Qualitative Detection of Metarhizium spp. in the Substrate
为了确保对植物响应的解释建立在真菌确已存活的基础上，研究人员在试验结束时对基质样本进行了真菌回收。未接种对照、施氮对照及仅接种根瘤菌的处理作为阴性对照，均未检出典型Metarhizium菌落；而所有接种Metarhizium的处理中均可稳定回收到具有特征性绿色分生孢子菌落。该结果说明，两株EPF在整个47 d试验期间于基质中保持可培养状态，从而支持其在根际持续存在并参与植物—微生物互作的判断。

讨论部分围绕方法学意义展开。研究人员指出，多功能微生物正成为农业可持续集约化的重要工具，而Metarhizium属的生态角色已从单纯昆虫生防因子扩展至植物促生与内生共生微生物。要实现其与Bradyrhizobium的联合应用，首要条件是消除拮抗风险。本研究提出的顺序化框架正是为此服务：先以低成本、可重复的体外双培养完成初筛，再在受控温室体系中验证其是否仍可维持结瘤和植物生长功能，最后辅以根系表型和真菌回收提升解释力。研究还讨论了采用砂砾—蛭石惰性基质的原因，即尽量减少土著微生物干扰，提高相容性判定的清晰度；但同时也明确指出，这种体系不能完全代表天然农田土壤，未来仍需在自然土壤和田间条件下进一步验证。作者还强调，根系形态分析是该框架的重要补充步骤，尤其细根数、总根数和分叉频率可作为吸收网络扩张的敏感指标，用于捕捉早期功能响应。至于真菌回收，虽然当前结果证实其在根际持续存在，但尚不能区分其仅具根际适应性还是已建立内生定殖，因此后续可结合组织分离或显微技术完善评价。

研究结论部分可译为：本研究建立了一种用于评估昆虫病原真菌（EPF）与根瘤菌相容性及共接种对植物生长和根系形态影响的方法学框架。通过整合体外相容性测定与温室精细形态计量分析，该方法刻画了这些微生物在根际中的互作结果。所提出的方法学已证明可有效用于筛选相容的微生物联合体，并在保证根瘤菌—豆科共生关系维持的同时，评价其对根系构型和生物量的潜在影响。该框架为多营养级微生物组合的战略筛选提供了工具，并为热带农业可持续生物投入品的开发提供了标准化路径。

总体而言，这篇发表在《Plants》的论文贡献主要不在于提出某一种极强促生组合，而在于建立了一套逻辑清晰、操作可重复、指标较完整的评价流程。其价值体现在：能够在微生物联合制剂开发早期快速排除不相容组合；能够用结瘤稳定性确保不牺牲大豆核心固氮功能；能够借助根系图像表型识别更细致的地下部功能变化；并通过基质回收为真菌持续存在提供证据。对于后续开发兼具害虫管理与根际促生潜力的复合生物投入品，该研究提供了可直接移植和扩展的方法学基础。