亚急性八氢-1,3,5,7-四硝基-1,3,5,7-四唑辛暴露诱导小鼠神经行为缺陷和海马脱髓鞘

《Toxics》：Subacute Octahydro-1,3,5,7-tetranitro-1,3,5,7-tetrazocine Exposure Induces Neurobehavioral Deficits and Hippocampal Demyelination in Mice

　　

八氢-1,3,5,7-四硝基-1,3,5,7-四唑辛（Octahydro-1,3,5,7-tetranitro-1,3,5,7-tetrazocine, HMX）是一种广泛用于军事和工业领域的硝胺炸药。尽管新出现的证据表明HMX具有神经毒性，但其中枢神经系统（CNS）损伤的机制仍大多未知。在本研究中，研究人员建立了28天亚急性HMX暴露的小鼠模型，以在体内探索HMX诱导的神经毒性及其潜在机制。行为学评估显示，HMX在旷场实验中增加了自发活动能力和中央区域探索，并减少了强迫游泳实验中的不动时间，表明情绪调节异常。Morris水迷宫进一步证明了HMX处理的小鼠存在海马依赖性空间学习与记忆受损，表现为平台潜伏期延长。组织病理学分析显示，HMX处理的小鼠海马出现脱髓鞘，伴随髓鞘结构蛋白（MBP、PLP1）和少突胶质细胞谱系蛋白（OLIG2、CNPase）的下调。此外，蛋白组学分析在HMX暴露的海马中鉴定出173个差异表达蛋白，这些蛋白在髓鞘形成、突触传递和神经活性配体-受体相互作用通路中富集。综上所述，研究人员的发现表明，亚急性HMX暴露诱导小鼠行为缺陷和海马脱髓鞘，为HMX神经毒性提供了新的机制见解，并为针对HMX暴露的职业健康防护提供了理论基础。

### 论文解读：亚急性八氢-1,3,5,7-四硝基-1,3,5,7-四唑辛（HMX）暴露诱导小鼠神经行为缺陷和海马脱髓鞘

#### 研究背景与问题

含能材料（如硝胺炸药）在军事、航天和采矿工业中不可或缺，但其生产和使用带来的生物毒性与环境风险日益受到关注。其中，环三亚甲基三硝胺（RDX）和六硝基六氮杂异伍兹烷（CL-20）已被证实具有严重的中枢神经系统（CNS）神经毒性，例如CL-20通过非竞争性阻断配体门控GABA_A受体离子通道引发神经毒性，而RDX可触发人类癫痫发作。作为另一种典型硝胺炸药，八氢-1,3,5,7-四硝基-1,3,5,7-四唑辛（HMX）广泛应用于采矿和军事工业。尽管急性毒性研究显示HMX的半数致死剂量（LD₅₀）相对较高（小鼠2000 mg/kg，大鼠6500 mg/kg），但累积证据表明HMX暴露可导致持续性CNS损伤。临床前研究已观察到HMX在脑内蓄积并诱发多种动物（兔、爬行类、啮齿类）的癫痫、抽搐和多动症。流行病学调查进一步发现，职业性HMX暴露与工人出现情绪障碍、注意力缺陷、记忆损害及周围神经传导速度改变等一系列神经症状相关。然而，HMX神经毒性的潜在机制至今尚不明确。研究人员前期的体外研究表明，HMX在分化型PC12细胞中产生显著的神经毒性，表现为钙超载、活性氧（ROS）生成增加以及神经营养因子和谷氨酸受体表达失调。基于此，本研究旨在利用小鼠模型探索亚急性HMX暴露的体内神经毒性效应并阐明其机制。

#### 研究内容与主要结论

研究人员建立了28天亚急性HMX暴露的小鼠模型（雄性C57BL/6小鼠，剂量梯度：40、100、250 mg/kg，灌胃给药），结合全面的行为学评估、组织病理学、免疫荧光和定量蛋白组学分析，系统研究了HMX诱导的神经行为缺陷和海马脱髓鞘机制。研究得出以下核心结论：亚急性HMX暴露可剂量依赖性地诱导小鼠神经行为异常，包括自发活动增加、焦虑样和绝望样行为减少（情绪调节异常），以及海马依赖性空间学习与记忆受损；这些行为缺陷与显著的海马脱髓鞘相关，但并未出现明显的神经元坏死；机制上，HMX暴露导致海马少突胶质细胞转录因子OLIG2表达下调，伴随成熟少突胶质细胞标志物CNPase和髓鞘结构蛋白MBP、PLP1减少；蛋白组学分析进一步揭示了髓鞘形成、突触传递及神经活性配体-受体相互作用等多条通路受干扰。该论文为HMX神经毒性提供了新的机制见解，并为针对HMX暴露的职业健康防护策略奠定了理论基础，发表于《Toxics》。

#### 主要关键技术方法（不超过250字）

本研究采用28天亚急性灌胃暴露模型（雄性C57BL/6小鼠），设三个剂量组（40、100、250 mg/kg）及溶剂对照组。行为学测试依次使用旷场实验（OFT）、强迫游泳实验（FST）和Morris水迷宫（MWM）评估情绪与认知功能。组织病理学采用苏木精-伊红（HE）染色、尼氏（Nissl）染色和固蓝（LFB）染色观察海马神经元形态与髓鞘完整性。免疫荧光染色检测髓鞘结构蛋白MBP、PLP1以及少突胶质细胞标志物CNPase和转录因子OLIG2的表达变化。蛋白组学方面，对对照组和高剂量组海马组织进行无标记定量蛋白组学，使用DIA-NN软件鉴定差异表达蛋白（DEPs），并通过Gene Ontology（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析及蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析探索分子机制。所有统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。

#### 研究结果

**3.1 HMX处理小鼠的焦虑样和绝望样行为减少**
通过旷场实验发现，中剂量（100 mg/kg）和高剂量（250 mg/kg）HMX组小鼠的总运动距离显著增加，中央区域探索（中央距离和中央进入次数）也显著增加，表明自发活动增强且焦虑样行为减少。强迫游泳实验中，中、高剂量组的不动时间显著缩短，提示绝望样行为减少。低剂量组（40 mg/kg）未见显著变化。

**3.2 HMX损害海马依赖性空间学习与记忆**
Morris水迷宫定位航行阶段，HMX处理组（尤其高剂量组在第3、4、5天，中剂量组在第4、5天）逃避潜伏期显著长于对照组。空间探索阶段，中、高剂量组在目标象限停留时间和穿越平台次数均显著减少，表明空间学习与记忆能力受损。

**3.3 HMX诱导海马脱髓鞘但无明显神经元坏死**
HE和Nissl染色未在HMX处理组海马观察到明显的神经元变性、坏死或丢失。但LFB染色显示中、高剂量组海马髓鞘染色强度降低，提示髓鞘含量减少，即存在脱髓鞘变化。

**3.4 HMX降低海马CA1、CA3和DG亚区髓鞘结构蛋白的免疫荧光强度**
免疫荧光染色显示，中、高剂量组海马CA1和齿状回（DG）亚区MBP免疫荧光强度显著降低；高剂量组CA1和DG亚区PLP1免疫荧光强度显著降低，中剂量组CA1亚区PLP1也显著降低。CA3亚区MBP无显著变化。

**3.5 HMX降低海马CA1、CA3和DG亚区少突胶质细胞相关蛋白的免疫荧光强度**
CNPase免疫荧光强度在中、高剂量组的CA1和DG亚区及高剂量组的CA3亚区显著降低。OLIG2免疫荧光强度在中、高剂量组的CA1和DG亚区及高剂量组的CA3亚区显著降低。提示HMX可能通过下调OLIG2抑制少突胶质细胞成熟。

**3.6 蛋白组学揭示HMX暴露后海马全局分子变化**
共鉴定8243种蛋白，其中173种差异表达（100种上调，73种下调）。亚细胞定位显示DEPs主要位于细胞核（29.84%）和质膜（23.39%）。神经相关蛋白如MBP、PLP1、CNPase、MOBP、MOG（髓鞘相关）以及突触功能蛋白BDNF、SYN3、SV2C均发生变化。KEGG富集显示DEPs显著富集于神经活性配体-受体相互作用、轴突导向、PI3K-Akt信号、Ras信号及氮代谢通路。GO富集显示主要富集于神经系统发育、突触传递、髓鞘组织等生物过程。PPI网络显示核心DEPs形成与髓鞘和神经元功能相关的互联簇。

#### 讨论与结论总结

讨论部分指出，HMX暴露减少焦虑样和绝望样行为这一表型与多数神经毒物引起的焦虑和抑郁样表型相反，但与RDX暴露啮齿类动物的多动及焦虑减少一致，提示硝胺炸药可能调节共同的情绪调控神经环路。这种行为改变并非“抗抑郁样”效应，而是CNS损伤导致的异常情绪处理。HMX暴露损害海马依赖性空间学习与记忆，且认知缺陷发生在无明显神经元坏死的背景下，表明HMX主要靶向髓鞘而非神经元。HMX暴露导致OLIG2下调，进而抑制少突胶质细胞前体细胞（OPCs）向成熟少突胶质细胞分化，减少髓鞘产生并引发脱髓鞘。免疫荧光与蛋白组学中OLIG2结果的差异源于采样范围和分析方式不同，免疫荧光靶向特定亚区而蛋白组学覆盖全海马。蛋白组学还发现突触蛋白（BDNF、SYN3、SV2C）下调及氮代谢通路富集，提示HMX可能透过血脑屏障产生活性氮物种（RNS）导致氧化应激，少突胶质细胞对此尤为敏感。与RDX（主要急性癫痫发作）相比，HMX通过靶向少突胶质细胞导致慢性脱髓鞘损伤。研究局限性包括：亚急性高剂量模型可能不完全模拟职业人群长期低剂量暴露；需要体外OPC分化实验或OLIG2过表达实验以确立因果关系；仅聚焦海马；仅使用雄性小鼠。结论部分翻译如下：亚急性HMX暴露诱导小鼠剂量依赖性的神经行为异常，包括多动、焦虑样和绝望样行为减少以及海马依赖性空间学习与记忆受损。这些缺陷与显著的海马脱髓鞘相关，且发生在无明显神经元坏死的情况下。机制上，HMX暴露与海马OLIG2表达下调相关，伴随成熟少突胶质细胞标志物CNPase和髓鞘结构蛋白MBP、PLP1表达减少。蛋白组学进一步揭示HMX破坏海马多个生物学过程，包括髓鞘形成、突触传递和神经活性配体-受体相互作用。这些发现为HMX神经毒性提供了新的机制理解，并对制定针对HMX暴露的职业健康防护策略具有重要意义。