《Bioengineering》：Articular Cartilage Tissue Engineering: Cells, Bioinstructive Scaffolds, Immunological Microenvironment, and Emerging Technologies
局灶性关节软骨缺损由于透明软骨（hyaline cartilage）无血管、无淋巴管及无神经的组织特性，内源性修复能力十分有限。骨髓刺激（marrow-stimulation）类手术常形成机械性能较差的纤维软骨，在较大或高负荷病灶中，其临床获益通常于2–5年内下降；而基质诱导自体软骨细胞植入（matrix-induced autologous chondrocyte implantation, MACI）虽可获得持久的10年疗效，但仍受制于两阶段治疗流程、体外去分化以及成本因素。本综述整合了关节软骨组织工程中的细胞学、生物材料学、生物化学及免疫学维度，并结合定量基准，对失败模式、可扩展性及监管现状进行了批判性评估。文章将MACI与单阶段软骨单位（chondron）及祖细胞（progenitor）治疗进行基准比较；考察来源于骨髓、脂肪、滑膜及髌下脂肪垫（infrapatellar fat pad, IFP）的间充质基质细胞（mesenchymal stromal cells, MSCs），并从机制层面解析驱动肥大性漂移（hypertrophic drift）的Wnt/β-catenin、IHH–PTHrP、RUNX2/MEF2C及HIF-1α信号输入；将支架重新定义为可传递机械、生化及摩擦学线索的生物指导性环境，包括刺激响应性系统、4D打印系统以及作为无创辅助策略的低强度脉冲超声（low-intensity pulsed ultrasound, LIPUS）；阐述病理改变的天然软骨、髌下脂肪垫–滑膜单元与工程化构建体之间的免疫学对话；并评价基于CRISPR的细胞工程以及人工智能在生物制造中的应用。文章进一步将主要策略划分为四个明确的转化层级，以提高各类技术证据等级的透明度。未来临床转化的推进速度，将取决于标准化效力检测（potency assay）、具备免疫感知的构建体设计，以及稳健的长期体内证据。
1. Introduction
文章首先指出，关节软骨覆盖滑膜关节的双关节面（diarthrodial surfaces），形成近乎无摩擦且可承重的界面，其功能依赖于层级化、各向异性的细胞外基质（extracellular matrix, ECM）。成人关节软骨中软骨细胞仅占组织体积约1–2%，却维持着由水、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖构成的高特化基质。也正因软骨无血管、无淋巴管及无神经，局灶性损伤后几乎缺乏有效的细胞迁移与系统性祖细胞募集，故内源性修复明显不足。文章进一步结合流行病学数据强调其临床意义：局灶性软骨缺损在膝关节镜患者中十分常见，并可能促成关节内分解代谢环境，增加后续骨关节炎（osteoarthritis, OA）风险。现有治疗以缓解疼痛和改善功能为主，但是否降低OA长期风险仍缺乏充分证据。治疗层面，微骨折等骨髓刺激技术因操作简便和成本低而广泛应用于小面积缺损，但生成组织多偏向Ⅰ型胶原主导的纤维软骨，长期结构和临床效果有限。相比之下，MACI作为第三代自体软骨细胞植入（autologous chondrocyte implantation, ACI）技术，已成为有监管批准地区的重要临床基准。本文据此提出四个分析视角：结构与生物力学、细胞来源、支架微环境以及免疫学维度，并进一步讨论CRISPR与人工智能等新方向。
2. Articular Cartilage: Structure, Composition and Biomechanical Demands
本节强调，成功的软骨再生必须尽可能重建天然组织的层级组织结构及其对应的力学行为，工程目标主要由ECM组成、区域分层结构以及非线性、深度依赖性生物力学响应共同决定。
2.1. Extracellular Matrix Composition
作者概述了软骨ECM的基本组成：水约占湿重65–80%，胶原约占10–20%，蛋白聚糖约占4–7%。其中Ⅱ型胶原占总胶原的90–95%，提供抗拉强度；Ⅸ、Ⅺ和Ⅵ型胶原则参与纤维交汇稳定及软骨细胞–基质耦联。聚集蛋白聚糖（aggrecan）是主要蛋白聚糖，其硫酸软骨素和角质素硫酸糖胺聚糖（glycosaminoglycan, GAG）链因固定负电荷形成Donnan渗透性膨胀压，并受胶原网络约束，从而赋予组织抗压能力。文章指出，若组织工程构建体中Ⅰ型胶原比例过高而Ⅱ型胶原不足，则可能破坏这一复合力学逻辑，导致透明软骨样功能和耐久性下降。
2.2. Zonal Architecture
文章将关节软骨划分为浅表层、中间层、深层和钙化层，并分别说明各层在细胞形态、胶原纤维排列及基质组成上的差异。浅表层厚度约占10–20%，软骨细胞扁平，Ⅱ型胶原纤维平行于关节表面排列，主要提供抗拉刚度和抗剪切能力，同时分泌蛋白聚糖-4（proteoglycan-4, PRG4）即润滑素（lubricin），维持边界润滑。中间层含较圆形软骨细胞、斜向纤维以及更高的蛋白聚糖含量。深层软骨细胞呈垂直柱状排列，纤维垂直于关节面，抗压能力最强。钙化层通过潮线（tidemark）与未钙化软骨分隔，并实现与软骨下骨的锚定及骨软骨界面的梯度力传递。作者认为，这种结构和功能上的连续梯度至今仍是组织工程最难完整复制的部分之一。
2.3. Biomechanical Behaviour Beyond the Biphasic Approximation
文章在经典双相多孔弹性模型（biphasic poroelastic model）基础上，进一步强调天然软骨并非简单双相材料，而是具有显著非线性、应变速率依赖性及空间异质性。瞬时受压时，间质液体加压可承担高达约90%的外加载荷；随着时间延长，液体经低渗透性基质缓慢外渗，组织发生蠕变并最终由固相ECM和蛋白聚糖渗透膨胀压承担负荷。文章给出了典型定量指标，如平衡模量约0.5–1.0 MPa，瞬时模量可接近50 MPa，且健康股骨髁中平衡模量从浅层约0.3 MPa上升至深层大于2 MPa。OA退变会导致该梯度降低、液压渗透率升高并使深度依赖性减弱。基于此，作者提出组织工程构建体至少应满足三项设计约束：形成深度分级的成分和纤维取向、具备与液体加压承载相匹配的瞬时/平衡模量比值、并可在潮线区域与钙化软骨及软骨下骨稳定整合。评价构建体成功与否，不应仅看缺损填充体积，而应以结构和力学靶点为核心标准。
3. The Bioengineering Triad: Cells, Bioinstructive Scaffolds, and Bioactive Signals
本节围绕现代软骨组织工程“三要素”——细胞、支架与生物活性信号——展开，但强调三者已由传统概念转向更具机制导向的设计框架。细胞选择强调表型稳定性，支架被视为生物指导性微环境，生物信号则不仅包括生长因子，还包括细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）及免疫调控线索。
3.1. Cellular Sources
作者将自体软骨细胞、MSCs及诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）视为目前最主要的三类细胞来源，并讨论其优势、限制及转化成熟度。
3.1.1. Autologous Chondrocytes and Single-Stage Therapies
本小节回顾了ACI向MACI演进的过程。MACI通过将扩增后的自体软骨细胞负载于Ⅰ/Ⅲ型胶原膜上进行植入，具备较强的长期临床证据支持。文章引用随机试验和长期系统综述说明，其在疼痛、功能和结构耐久性方面均优于微骨折等技术。然而，MACI仍存在两阶段流程、单层扩增期间软骨细胞去分化以及高成本等问题。为克服这些限制，单阶段策略通过术中采集、处理和即时回植减少体外培养依赖，包括最小操作自体软骨细胞、保留周细胞基质的软骨单位（chondron）构建体，以及软骨单位与骨髓或滑膜来源基质细胞联合植入。文章认为，这些方法体现了一个重要范式转变：植入细胞不再仅被视为结构构件，也被看作通过旁分泌和免疫调控作用组织宿主修复的信号来源。
3.1.2. Mesenchymal Stromal Cells: Source Selection and the Hypertrophy Problem
作者详细讨论了MSCs在软骨工程中的核心地位及其主要障碍——肥大性漂移。骨髓来源（BM-MSC）、脂肪来源（ASC）、滑膜来源（SM-MSC）、脐带来源及髌下脂肪垫来源（IFP-MSC）细胞虽符合国际细胞治疗学会（ISCT）最低标准，但在软骨生成能力、肥大倾向及获取便利性方面差异明显。SM-MSC与IFP-MSC通常表现出更优的软骨生成潜力。问题在于，TGF-β诱导下的MSC软骨分化常伴随COL10A1、MMP13、RUNX2和碱性磷酸酶上调，最终走向钙化和软骨内成骨，而非稳定透明软骨表型。作者将此解释为胚胎生长板程序的再现，而非单纯培养伪影。机制上，Wnt/β-catenin、IHH–PTHrP、RUNX2/MEF2C、p38、ERK1/2以及HIF-1α–SOX9等通路共同决定细胞命运。现有抑制策略包括2–5% O
2低氧预适应、TGF-β3与BMP-6联合PTHrP信号、机械预处理及模拟浅中层低刚度高含水生态位的基质线索，但总体上仅能减弱而难以彻底消除肥大表型。作者据此认为，下一代MSC产品更需要多节点联合干预，而非单一通路抑制。与此同时，ASC因易于高产量获取而适合与功能化水凝胶联合应用；IFP-MSC兼具可及性和免疫调节潜能，但其受病变关节炎性环境“预激活”的功能状态亦带来可重复性与效力评价问题。
3.1.3. Induced Pluripotent Stem Cells
文章认为，人iPSCs在理论上可提供几乎无限扩增能力和患者特异性来源，从而缓解原代软骨细胞和MSCs供体有限的问题。采用发育启发式方案和三维聚集培养，可获得相对稳定的软骨祖细胞群体，且部分研究提示其肥大倾向可能低于MSC来源细胞。非人灵长类模型中，异体iPSC来源软骨类器官已显示出存活、整合及修复能力。但作者同时指出，其临床转化仍受限于基因组稳定性、残余未分化细胞的致瘤风险、符合药品生产质量管理规范（good manufacturing practice, GMP）的规模化生产以及多能来源先进治疗药物产品（advanced therapy medicinal product, ATMP）的监管负担。
3.2. Scaffolds as Bioinstructive Microenvironments
本节将支架定义为同时承担力学支撑、生物诱导、降解匹配与摩擦学调控的“生物指导性微环境”。理想支架不仅应填充缺损，还要提供接近天然软骨的刚度和分层调控能力，递送TGF-β3、BMP-2、kartogenin、RGD或YIGSR等软骨诱导信号，并具备与新组织形成相匹配的降解动力学。表面若以PRG4或透明质酸（hyaluronic acid, HA）功能化，还可降低摩擦系数，保护浅表层细胞表型。
3.2.1. Natural and Synthetic Hydrogels
文章指出，水凝胶因其高含水三维网络最接近软骨ECM，是研究最广泛的软骨生物材料。天然聚合物如HA、胶原、明胶、海藻酸盐、壳聚糖和丝素蛋白具备内在生物识别能力，但力学可调性和批次一致性不足；聚乙二醇（poly(ethylene glycol), PEG）和聚乙烯醇（poly(vinyl alcohol), PVA）等合成体系则可提供更高可控性，但生物活性较弱。复合和动态交联体系试图整合两者优势。明胶甲基丙烯酰（gelatin methacryloyl, GelMA）因具备光交联可控性、RGD基序及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）可裂解位点，已成为常用软骨生物墨水。
3.2.2. Decellularised Extracellular Matrix
去细胞外基质（decellularised extracellular matrix, dECM）因保留天然胶原、GAG、纤连蛋白及生长因子结合域等复杂化学信息，被视为比纯合成系统更接近天然微环境。文中指出，软骨或骨软骨来源dECM可制成溶解态、颗粒态或与聚己内酯（polycaprolactone, PCL）增强的复合形式，并在体外和小动物中表现出软骨诱导活性。尽管相关荟萃分析支持其修复潜力，但去细胞工艺、来源组织和交联方式的异质性仍限制证据解释。光活化dECM生物墨水则在提高构建体刚度的同时尽量保持残余生物活性。
3.2.3. D Bioprinting and Zonal Constructs
作者强调，骨软骨单元具有明显的区域连续梯度，单一均质支架难以有效重建。三维生物打印通过空间可控沉积多种生物墨水、细胞和信号，为构建多相或分区构建体提供了技术基础。数字光处理（digital light processing, DLP）因无喷嘴、剪切损伤小、分辨率高且适于分层梯度构建，在软骨打印中具有独特优势。已有研究利用序贯DLP打印胶原梯度生物墨水，构建具有透明软骨–钙化层–骨连续过渡的骨软骨支架，并诱导BM-MSC发生区域特异性分化。文章同时指出，这类梯度构建体的长期体内耐久性仍待验证。
3.2.4. Stimuli-Responsive Scaffolds and Ultrasound-Activated Systems
本小节介绍了刺激响应性“智能”水凝胶，其可根据pH、温度、活性氧（reactive oxygen species, ROS）、酶、光、机械载荷或超声等外部/内部刺激改变膨胀、刚度、降解及载荷释放。OA关节因具有慢性炎症、氧化应激及MMP富集环境，成为此类系统的重要适用场景。文中举例说明ROS响应性水凝胶可清除ROS并局部释放治疗载荷，温敏注射型水凝胶则适于关节镜下不规则缺损填充。超声方面，低强度脉冲超声（LIPUS）可激活整合素介导机械转导、ERK1/2和PI3K/Akt信号，上调SOX9、COL2A1和ACAN，并抑制IL-1β诱导的NF-κB活化；在MSC软骨生成中，还可调节自噬并增强基质沉积及外泌体释放。若与含压电微粒或空化增强组分的超声响应水凝胶结合，还可实现时空可控的生长因子释放和按需刚度调节。不过作者明确提示，这一方向仍处于研究阶段，尚需解决剂量标准化、穿透深度、热损伤风险、GMP一致性及组合产品监管路径等问题。
3.3. Bioactive Signals and the Microenvironment
本节聚焦于生长因子递送、细胞旁分泌与细胞无关策略，以及病理软骨和组织工程构建体所处的免疫微环境。
3.3.1. Growth Factors and Spatiotemporal Delivery
作者指出，TGF-β超家族配体如TGF-β1、TGF-β3和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPs）是间充质凝聚、软骨分化和ECM合成的关键调控因子，但其效应高度依赖递送时机与持续时间。简单推注容易出现快速清除、半衰期短及异位效应，而持续或失衡信号又可能导致肥大、纤维化或异位骨化。因此，当前研究更强调时空控制递送平台，如基于亲和结合、纳米/微球载体及刺激响应系统的方式，以提高疗效并减少副反应。
3.3.2. Paracrine and Cell-Free Strategies: Extracellular Vesicles and Progenitor-Recruiting Constructs
本小节强调，MSC疗效相当部分来自旁分泌分泌组而非长期植入定植。MSC来源小型细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs）可携带miR-92a-3p、miR-140、miR-100-5p等miRNA以及多种蛋白和脂质，可能调控软骨细胞增殖、ECM代谢与炎症。文章同时规范术语，指出“exosome”应保留给证实具有内体来源的囊泡。所谓“cell-free”策略，是指不递送外源细胞，而依赖内源祖细胞募集或EV等旁分泌信号来完成修复，这属于原位组织工程范式。相关注射型、自愈型、外泌体交联水凝胶已在体内显示出促进透明软骨样新生组织形成及骨软骨整合的潜力。然而，作者对该方向保持审慎态度，提出五个关键未决问题：缺乏统一效力检测、GMP规模化生产困难、关节腔内生物分布不清、货载组成受母细胞异质性影响明显、以及监管分类尚未统一。因此，该类疗法虽具前景，但仍主要属于前临床阶段。
3.3.3. Immune Responses to Pathologically Altered and Tissue-Engineered Cartilage
文章在本小节中对“软骨免疫豁免”这一传统观点进行了修正，指出OA关节本质上是低度炎症性环境，先天与适应性免疫共同参与软骨破坏，而工程化构建体还将面临异物反应。病理软骨中，机械和氧化损伤释放损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs），包括纤连蛋白片段、透明质酸低聚物、HMGB1、S100A8/9和聚集蛋白聚糖片段，这些信号通过Toll样受体2/4（TLR2/TLR4）激活NF-κB并诱导IL-1β、TNF-α、IL-6及MMP、ADAMTS等降解酶表达。滑膜巨噬细胞趋向M1促炎表型，进一步加剧基质丢失和软骨细胞凋亡。作者特别强调髌下脂肪垫（IFP）并非惰性填充结构，而与滑膜共同构成解剖–功能单元；在老龄和肥胖背景下，该单元出现脂肪细胞肥大、纤维化和CD68
+巨噬细胞浸润，释放leptin、adipsin、IL-6、TNF-α和前列腺素，对软骨和滑膜产生旁分泌影响。这一IFP–滑膜单元既可干扰修复，也构成治疗靶点，同时又是IFP-MSC的重要来源。关于病变关节中IFP-MSC的功能状态，文章认为其往往受炎性环境“预激活”，可能增强免疫调节和镇痛特征，但也带来软骨分化忠实性、供体差异和重复性方面的问题，因此供体关节状态应纳入产品放行变量。对于植入构建体本身，作者进一步讨论了蛋白吸附、单核细胞黏附、巨噬细胞融合及M1主导纤维包裹等异物反应过程，并指出孔隙结构、表面化学、内毒素污染、降解动力学以及异种dECM中的α-Gal残留等因素均会影响免疫走向。相应地，IL-4/IL-13、吲哚胺2,3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO）表达细胞及免疫调节型水凝胶被提出为潜在优化策略。
3.4. Translational Maturity: Clinically Validated, Preclinical and Speculative Approaches
为避免不同证据等级技术被同等看待，作者建立了四级转化成熟度框架。Tier I包括已有监管批准且具备随机长期数据的技术，如微骨折、MACI及骨软骨自体移植；Tier II包括已有首次人体或早期临床证据但缺乏长期随机对照的策略，如单阶段软骨单位–MSC联合植入及LIPUS在软骨中的应用；Tier III涵盖主要由体外和小动物证据支持的技术，包括异体iPSC软骨类器官、dECM构建体、刺激响应水凝胶、MSC-EV产品、免疫调节支架、DLP或挤出生物打印分区构建体以及CRISPR编辑修复细胞；Tier IV则为概念可行但软骨特异性体内或临床证据仍稀缺的方向，如4D打印形状记忆支架、AI生成分区微结构和闭环生物反应器成熟系统。该框架的意义在于使技术距离临床的真实程度更加透明，并为后续证据积累提供评价坐标。
4. Emerging Directions
本节聚焦于基因编辑、先进生物制造及人工智能等前沿方向，并在强调潜力的同时突出其现实限制。
4.1. CRISPR-Based Cell Engineering
作者指出，CRISPR/Cas系统在软骨领域更可能作为植入前细胞工程平台，而非直接体内治疗。已有前临床研究表明，敲除MMP13可减少基质降解并增加Ⅱ型胶原积累，而通过CRISPR介导SOX9转录激活并抑制RELA，则可同时增强MSC的软骨生成与免疫调节输出。尽管如此，文章认为其距离可监管的软骨产品仍有较大距离，障碍主要包括原代细胞高效编辑与表型保持之间的矛盾、脱靶和结构变异评估负担、编辑嵌合性对批次效力与放行的一致性影响，以及骨科领域缺乏明确监管路径。相较于简单敲除，CRISPRa、CRISPRi、碱基编辑和引导编辑可能提供更精细的可编程转录调控，但同样需要严格的安全性和稳定性验证。
4.2. Advanced Biofabrication
本小节介绍了超越常规DLP和挤出生物打印的先进制造技术。双光子聚合可实现亚微米尺度结构，用于模拟周细胞基质级别线索；熔融静电直写（melt electrowriting）可沉积定向PCL微纤维，并与水凝胶浸润构成在刚度、各向异性及区域组织上更接近天然软骨的复合材料。生物墨水也正由单一聚合物向GelMA–甲基丙烯化透明质酸（methacrylated hyaluronic acid, HAMA）、dECM补充型及纳米纤维素增强型体系演进。生物反应器成熟系统结合压缩、剪切、灌流及拉曼光谱、光学相干弹性成像等无创监测，有望缩短设计–验证循环。关于4D打印，文章认为其通过形状记忆或刺激变形材料将制造扩展至时间维度，具有微创植入和不规则缺损自适应填充的概念吸引力。已有骨组织和软骨概念验证研究显示其可在近体温或近红外触发下恢复预设形状，但在软骨领域仍存在近红外穿透深度不足、高温风险、长期负重滑膜环境下耐久性未知及缺乏成熟监管路径等问题，因此目前仍属较为推测性的方向。
4.3. Artificial Intelligence and Data-Driven Approaches
文章认为，人工智能（artificial intelligence, AI）和机器学习（machine learning, ML）适用于处理软骨组织工程中参数空间巨大的优化问题，如生物墨水可打印性与生物相容性的权衡、支架几何和材料组合优化以及制造过程控制。现有应用包括基于流变学、喷嘴参数和环境条件预测生物墨水打印性能和打印后支架质量，也包括更广义的支架设计、药物递送优化和图像分析框架。更前沿的设想还包括面向目标刚度的分区微结构生成设计、自动化组织学与MRI T
2图谱定量，以及生物反应器闭环控制。然而作者强调，软骨特异性高质量公开数据集依然稀缺，模型外部泛化能力有限；深度模型解释性不足，不利于临床和监管接受；一旦AI介入器械几何、批次放行或植入选择，还将受到医疗器械软件（Software-as-a-Medical-Device, SaMD）和欧盟医疗器械法规（EU MDR）框架约束。因此，AI更适合作为经过验证流程中的明确优化环节，而非脱离生物学约束的自由设计生成器。
5. Conclusions
结论部分认为，关节软骨组织工程已从单纯“填充缺损”转向重建具有深度分级、力学胜任力和免疫耐受性的组织。MACI仍是当前临床重要标杆，但其两阶段流程、去分化风险和高成本推动了单阶段软骨单位/祖细胞疗法、ASC和IFP-MSC策略以及细胞无关构建体的发展。支架已不再是被动载体，而是整合机械、生化和免疫信号的生物指导性环境。作者明确指出，未来突破不太可能来自单一技术点，而将取决于若干关键要素的协同：一是建立标准化效力检测以客观评价细胞来源与产品批次；二是将免疫感知设计纳入下一代构建体的基本要求，包括促进M2极化的孔隙与表面化学设计、控制内毒素和α-Gal负荷以及整合局部免疫调节因子；三是对刺激响应系统、4D打印、CRISPR及AI等新技术开展长期、规范化的体内验证与监管对接。总体而言，文章主张通过细胞、支架、信号与免疫环境的整合式设计，推动关节软骨再生从概念验证走向稳健转化。
