《Biology》：Comparative Genomic Analysis Uncovers the Evolutionary Basis of Siliceous Cell Wall Formation Across Diverse Lineages
编辑推荐：
研究人员使用葡聚糖硫酸钠（DSS）在猪模型中诱导溃疡性结肠炎，以研究发炎结肠组织中的转录响应。十一头猪被分为两组，其中五头猪每天口服DSS，持续五天，而六头未处理的猪作为对照组。处理组与对照组之间的转录本表达差异鉴定出425个下调mRNA和780个上调mRNA
研究人员使用葡聚糖硫酸钠（DSS）在猪模型中诱导溃疡性结肠炎，以研究发炎结肠组织中的转录响应。十一头猪被分为两组，其中五头猪每天口服DSS，持续五天，而六头未处理的猪作为对照组。处理组与对照组之间的转录本表达差异鉴定出425个下调mRNA和780个上调mRNA，响应DSS处理。还鉴定出59个差异表达miRNA，包括20个上调miRNA和39个下调miRNA。上调基因的最显著富集的KEGG（京都基因与基因组百科全书）通路为乳腺癌（ssc05224）、胃癌（ssc05226）、黏着斑（ssc04510）和PI3K-Akt信号通路（ssc04151）。上调基因的顶级基因本体（GO）术语为血管发育（GO:0001568）、细胞外基质和外部封装结构（GO:0031012）。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析鉴定出三个枢纽基因，包括LOXL1（赖氨酰氧化酶样1）、MFAP2（微纤维相关蛋白2）和FSTL3（卵泡抑素样3）。识别出17个高置信度miRNA-mRNA配对，并且两个基因（CD101和AVL9）通过双荧光素酶报告基因实验被确认为ssc-miR-24-3p的靶标。研究人员的研究提供了对mRNA和miRNA在调控猪DSS诱导结肠炎中关键作用的更好理解，并定义了编码和非编码RNA转录本集合，这些可能作为溃疡性结肠炎的干预靶点或生物标志物。
### 论文解读：猪DSS诱导结肠炎模型的转录组与miRNA调控网络分析
#### 研究背景与问题
炎症性肠病（IBD），包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病，以胃肠道慢性炎症和结直肠癌风险升高为特征，其病因涉及遗传易感性、肠道菌群失调、环境因素及个体生活方式等多种因素。UC的临床表型异质性高，包括腹泻、直肠出血、腹痛、便急等，并可引发严重并发症如自身免疫反应、中毒性巨结肠及结肠癌。深入理解UC的特定病理生理学和分子调控机制对疾病预防和治疗至关重要。葡聚糖硫酸钠（DSS）作为一种磺化多糖，可破坏结肠肠上皮屏障，诱导肠道炎症，已在啮齿动物模型中广泛用于UC研究。猪模型因其与人类在胃肠道解剖结构和生理上的高度相似性（如绒毛结构和肠上皮细胞组成），成为可靠的DSS诱导结肠炎模型，可用于评估膳食补充剂、益生菌及宿主-微生物互作等干预策略。然而，目前对猪模型中DSS诱导结肠炎的转录组（mRNA）和小RNA（miRNA）整合调控网络尚缺乏全面表征，急需通过高通量转录组分析揭示其分子机制，为UC提供潜在生物标志物和治疗靶点。
#### 研究人员开展的研究与结论
研究人员采用前期研究中的猪结肠组织样本（11头猪，DSS组n=5，对照组n=6），通过RNA测序（RNA-seq）和小RNA测序（small RNA-seq）分析mRNA和miRNA表达谱。鉴定出1205个差异表达转录本（425个下调、780个上调）和59个差异表达miRNA（20个上调、39个下调）。功能富集分析显示，上调基因显著富集于血管发育、细胞外基质、黏着斑和PI3K-Akt信号通路；下调基因富集于蛋白酶体、细胞因子-细胞因子受体相互作用及IgA产生的肠道免疫网络。通过蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析，鉴定出三个枢纽基因（LOXL1、MFAP2、FSTL3）。结合miRNA靶标预测（miRanda、RNAhybrid、RNA22）和表达负相关分析，获得17个高置信度miRNA-mRNA配对，并通过双荧光素酶报告基因实验验证了ssc-miR-24-3p靶向CD101和AVL9基因。研究表明，血管发育和癌症相关通路在DSS诱导的结肠炎中激活，这些发现为UC的分子调控机制提供了初步计算证据，并提出了潜在的干预靶点和生物标志物。该论文发表在《Biology》。
#### 主要关键技术与方法
研究人员从前期研究（已发表）中获取11份猪结肠组织样本（DSS组5份，对照组6份），提取总RNA，分别进行mRNA文库和小RNA文库构建，并在Illumina HiSeq平台测序。关键技术包括：使用Hisat2比对mRNA读段至猪参考基因组Sscrofa11.1，StringTie组装定量，Ballgown鉴定差异表达转录本；使用DESeq2分析差异表达miRNA；使用clusterProfiler进行基因本体（GO）和KEGG通路富集分析；使用STRING数据库构建PPI网络，并通过CentiScaPe和CytoHubba插件识别枢纽基因；使用miRanda、RNAhybrid和RNA22进行miRNA靶标预测，结合Spearman相关性筛选高置信度miRNA-mRNA配对；最后通过双荧光素酶报告基因实验验证ssc-miR-24-3p对CD101和AVL9的靶向调控。
#### 研究结果
**3.1 质量控制与比对**：RNA-seq平均产生约7880万原始读段，过滤后约6740万（CON组）和7880万（DSS组）干净读段，约74-76%比对至猪参考基因组。小RNA-seq平均产生约2110万原始读段，过滤后约2040万（CON组）和1960万（DSS组）干净读段，比对率52-78%。
**3.2 高丰度与差异表达转录本鉴定**：共获得22,779个注释转录本和20,700个预测新转录本。鉴定出425个下调转录本和780个上调转录本（调整p<0.05，|Log2FC|>1）。最显著上调转录本为C-X-C基序趋化因子配体（CXCL14），最显著下调转录本为注释新转录本ENSSSCT00000084926。六种基因（如COL6A1）表现出转录本特异性差异表达，例如COL6A1的三个转录本中两个上调、一个下调。
**3.3 差异表达转录本的功能富集分析**：上调转录本富集于424个显著GO项，最显著的是外部封装结构（GO:0030312）、细胞外基质（GO:0031012）和血管发育（GO:0001568），涉及31、31和38个基因。KEGG通路富集显示显著通路包括黏着斑（ssc04510）、PI3K-Akt信号通路（ssc04151）、ECM-受体相互作用及阿米巴病，涉及28、36、16和16个基因；七个基因共同富集于这四个通路。下调转录本富集于三个GO项（蛋白酶体核心复合物、蛋白酶体复合物、内肽酶复合物）和三个KEGG通路（蛋白酶体、细胞因子-细胞因子受体相互作用、IgA产生的肠道免疫网络），涉及7、15和6个基因；四个基因（CCL28、TNFSF13、CCR10、TNFRSF17）共同富集于这三个通路。
**3.4 通过蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析鉴定枢纽基因**：利用STRING数据库构建PPI网络，包含869个节点和2989条边（阈值0.4）。通过Degree、Betweenness和Eigenvector三个中心性参数筛选，获得160个高中心性基因。使用CytoHubba的MCC、Degree和MNC算法，三个上调基因（LOXL1、MFAP2、FSTL3）均位列前十，被确定为枢纽基因。LOXL1与七个其他上调基因互作，如ASAMTS10、EFEMP2等。
**3.5 高丰度与差异表达miRNA鉴定**：主成分分析显示CON和DSS组miRNA表达谱分离。鉴定出59个差异表达miRNA（20个上调、39个下调）。最显著上调miRNA为ssc-miR-146b和ssc-miR-22-3p，最显著下调为ssc-miR-2320-5p和ssc-miR-92a。
**3.6 候选miRNA-mRNA调控相互作用鉴定**：基于Spearman相关系数，在442个差异表达转录本与59个miRNA之间，鉴定出19,111个正相关对（r>0.6，p<0.05）和14,597个负相关对（r<-0.6，p<0.05）。通过miRanda、RNAhybrid和RNA22预测，结合负表达相关和3'UTR结合位点，最终获得17个高置信度miRNA-mRNA交互作用（如miR-24-3p靶向AVL9和CD101）。
**3.7 ssc-miR-24-3p靶向CD101和AVL9基因的验证**：双荧光素酶报告基因实验显示，ssc-miR-24-3p模拟物与CD101-WT或AVL9-WT共转染显著抑制萤火虫/海肾荧光素酶活性，而与突变型共转染无抑制作用，证实ssc-miR-24-3p特异性结合CD101和AVL9的3'UTR。
#### 讨论与结论
讨论部分指出，猪模型因胃肠道解剖和生理与人类相似，是研究UC的理想模型。本研究通过转录组分析发现DSS诱导后CXCL14、PTGS2、IL-6等促炎和促血管生成基因上调，且血管发育和癌症相关通路显著激活，与既往研究一致。PI3K-Akt和黏着斑通路中22个基因（如AKT3、IGF1、SPP1）共同富集，提示其协同作用。枢纽基因LOXL1（参与ECM胶原交联）、MFAP2（微纤维组装）和FSTL3（分泌糖蛋白，调节免疫）可能在结肠炎中发挥重要作用。miR-24-3p靶向AVL9和CD101，其中AVL9高表达与结直肠癌预后不良相关，CD101可抑制致结肠炎T细胞扩增，其缺失加剧DSS结肠炎。研究局限性包括：预测关系需进一步实验验证；部分转录本功能未知；样本量小；未整合蛋白质组学数据。结论：本研究在mRNA和miRNA水平提供了猪DSS诱导结肠炎分子特征的初步计算证据，鉴定出22个富集于黏着斑和PI3K-Akt通路的基因、三个枢纽基因（LOXL1、MFAP2、FSTL3）及17个高置信度miRNA-mRNA配对（如miR-24-3p靶向AVL9，ssc-miR-132靶向CCL28），为理解DSS结肠炎的分子景观提供了基础，并提出了候选通路和基因靶点，可作为未来实验验证的潜在诊断标志物或治疗靶点。
