《Biology》：Murine and Humanized Mouse Models in Autoimmune Disease Research and Therapeutics Development
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精子质量是种公猪繁殖性能的关键决定因素，新出现的证据表明，精液微生物组可能影响精子功能。然而，精浆微生物组的组成及其与精子质量的关系仍不明确。本研究旨在探究公猪精浆的微生物组成及其与精子质量的关系。研究人员从杜洛克公猪收集的精液样本被分析并分类为合格（正常形态
精子质量是种公猪繁殖性能的关键决定因素，新出现的证据表明，精液微生物组可能影响精子功能。然而，精浆微生物组的组成及其与精子质量的关系仍不明确。本研究旨在探究公猪精浆的微生物组成及其与精子质量的关系。研究人员从杜洛克公猪收集的精液样本被分析并分类为合格（正常形态≥70%）或不合格（正常形态<70%）。通过离心分离精浆，并使用16S/ITS rRNA基因测序进行分析。优势细菌门为厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）。最丰富的属包括卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、拟杆菌属（Bacteroides）和枝孢菌属（Cladosporium）。在不合格样本中，细菌微生物组的香农多样性指数（Shannon diversity index）显著更高（p = 0.038）。此外，相关性分析显示，柔膜菌门（Tenericutes）与精子浓度呈负相关（r = ?0.90；p = 0.014）。线性判别分析（LDA）识别出与精子质量相关的微生物生物标志物，包括红球菌属（Rhodococcus）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、乳杆菌属（Lactobacillus）、链球菌属（Streptococcus）和埃姆佩多杆菌属（Empedobacter）。这些属在不合格样本中丰度增加，表明正常精液微生物群落受到破坏。总之，公猪精浆含有独特的细菌和真菌微生物组，该微生物组与精子形态相关。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
在养猪业中，公猪精液质量是决定人工授精（AI）成功率和商业生猪生产效益的关键因素。传统上，精液评估主要依赖精子活力、形态和浓度等参数。然而，精液并非无菌，其含有来源于包皮、尿道、环境及操作过程中的微生物群落，包括细菌和真菌。这些微生物可能通过代谢产物、营养竞争或直接损伤精子细胞而影响精子功能。尽管人工授精中心采用严格卫生措施（如双手套采集技术）并添加抗生素，但细菌污染（菌精症）仍难以完全避免。传统培养方法仅能检测可培养细菌，且无法全面揭示微生物组与精子质量的关联。近年来，16S rRNA测序等分子技术使精液微生物组的深入研究成为可能。然而，关于公猪精浆微生物组及其与精子形态等质量参数关系的研究仍十分有限，特别是在不同精子质量（合格与不合格）样本间的比较。本研究旨在填补这一空白，通过高通量测序全面表征公猪精浆微生物组，并评估其与精子质量的关联。
**研究内容与结论**
研究人员从美国Prestage Farms Inc.（West Point, MS, USA）商业公猪站收集45头健康、经证实可育的杜洛克公猪精液，每头公猪贡献一份射精样本。根据商业标准（正常形态≥70%），将样本分为合格组（Passed，n=10）和不合格组（Failed，n=10），所有样本总活力均>70%，故以正常形态为主要分组依据。通过离心分离精浆，采用16S rRNA基因（V3-V4区）和ITS2区域扩增子测序分析微生物组成，并使用qPCR进行绝对定量。生物信息学分析包括DADA2流程、QIIME v1.9.1、LEfSe及Spearman相关性分析。研究发现：公猪精浆含有复杂的细菌和真菌群落，细菌共鉴定出25个门、429个属、2013个种；真菌有4个门、28个属、35个种。优势细菌门为厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria），其中厚壁菌门在不合格组相对丰度更高（45.2% vs. 33.2%）。真菌门以担子菌门（Basidiomycota）为主。在α多样性方面，不合格组细菌香农指数显著更高（p=0.038），表明物种丰富度和均匀度增加；β多样性无显著差异。LEfSe分析识别出与精子质量相关的生物标志物：合格组富集红球菌属（Rhodococcus）和鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）等；不合格组富集柔膜菌门（Tenericutes）、梭菌纲（Clostridia）、链球菌属（Streptococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）和埃姆佩多杆菌属（Empedobacter）等。相关性分析显示，柔膜菌门与精子浓度呈强负相关（r=?0.90，p=0.014），而细菌α多样性（香农指数和辛普森指数）与正常形态呈显著负相关。该研究发表在《Biology》期刊。
**关键技术与方法**
1. **样本采集与分组**：从美国商业公猪站（Prestage Farms Inc.）收集45份杜洛克公猪精液，根据正常形态≥70%标准分为合格组（n=10）和不合格组（n=10），所有样本总活力均>70%。
2. **16S/ITS rRNA基因扩增子测序**：对精浆DNA进行V3-V4区16S rRNA和ITS2区域靶向测序，使用Illumina Nextseq平台，DADA2流程处理数据，QIIME v1.9.1进行分类注释和多样性分析。
3. **绝对定量qPCR**：通过标准曲线法对细菌16S rRNA基因和真菌ITS2区域进行绝对拷贝数定量，估算微生物DNA浓度。
4. **生物信息学与统计分析**：使用LEfSe（线性判别分析效应大小）识别组间差异微生物生物标志物；Spearman相关性分析评估微生物丰度与精子参数（活力、形态、浓度、近端滴）的关系；α多样性（Chao1、Shannon、Simpson）和β多样性（Bray-Curtis距离，PERMANOVA检验）比较。
**研究结果**
- **3.1 精液质量分析**：合格组的总活力、前向活力、正常形态、精子浓度和近端滴均显著高于不合格组（p<0.05）。
- **3.2 绝对丰度**：不合格组细菌16S rRNA基因拷贝数（平均261,284.9 ± 153,363.7 copies/μL）高于合格组（35,229.7 ± 14,786.0 copies/μL），但差异不显著（p=0.571）；真菌ITS基因拷贝数类似（p=0.236）。阴性对照未检出。
- **3.3 分类学概况**：细菌门水平，厚壁菌门在不合格组相对丰度更高（45.2% vs. 33.2%），拟杆菌门在合格组更高（37.6% vs. 33.7%），但均无显著差异。属水平，卟啉单胞菌属（Porphyromonas）在合格组更高（21.9% vs. 11.8%）；枝孢菌属（Cladosporium）在不合格组更高（25.0% vs. 11.4%）。真菌门中，担子菌门（Basidiomycota）最常见。
- **3.4 微生物多样性**：α多样性中，不合格组细菌Shannon指数显著更高（p=0.038），Chao1无差异；真菌无显著差异。β多样性（Bray-Curtis）在细菌和真菌中均无显著组间差异。
- **3.5 微生物生物标志物**：LEfSe分析（LDA>2.8）识别出97个细菌生物标志物。合格组富集：鞘氨醇单胞菌科（Sphingomonadaceae）、诺卡氏菌科（Nocardioidaceae）及红球菌属（Rhodococcus）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）。不合格组富集：柔膜菌门（Tenericutes）、梭菌纲（Clostridia）、柔膜菌纲（Mollicutes）及链球菌属（Streptococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、埃姆佩多杆菌属（Empedobacter）等。真菌中，银耳纲（Tremellomycetes）在不合格组显著富集。
- **3.6 相关性分析**：细菌门中，柔膜菌门与精子浓度呈负相关（r=?0.90，p=0.014）；真菌门中，子囊菌门（Ascomycota）与精子浓度呈正相关（r=0.80，p=0.027）。细菌α多样性（Shannon和Simpson指数）与正常形态呈显著负相关（r=?0.95，p<0.001；r=?0.86，p=0.012）。真菌α多样性无显著相关。
**讨论与结论**
讨论部分指出，公猪精浆中存在复杂的微生物群落，其组成与精子质量相关。合格组中富集的鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和红球菌属（Rhodococcus）可能具有保护作用，而此前研究也报道鞘氨醇单胞菌属与人类精子活力正相关。不合格组中富集的柔膜菌门（Tenericutes）与精子浓度负相关，支持其潜在致病性。梭菌纲（Clostridia）增加可能指示菌群失调，其内毒素可损伤精子细胞。链球菌属（Streptococcus）的作用具有情境依赖性，不同研究结果矛盾，可能与种属差异有关。乳杆菌属（Lactobacillus）通常被认为有益，但某些种（如Lactobacillus iners）可能与精子质量下降相关，本研究缺乏种水平分辨率。真菌中银耳纲（Tremellomycetes）的富集可能源于环境污染，其成员包括机会致病菌（如Trichosporon、Cryptococcus），但因果关系未证实。研究局限性包括样本量小、单个品种、缺乏物种水平分辨率及功能验证。
**结论**：本研究首次对未加抗生素的公猪精液进行微生物组分析，表明公猪精浆含有与精子形态相关的细菌和真菌群落。不合格精液富集厚壁菌门、梭菌纲、拟杆菌属、座囊菌纲（Dothideomycetes）和枝孢菌属（Cladosporium）；合格精液富集变形菌门、卟啉单胞菌属和马拉色菌纲（Malasseziomycetes）。潜在生物标志物包括：链球菌属、乳杆菌属、梭菌纲和银耳纲（不合格精液）；鞘氨醇单胞菌属和红球菌属（合格精液）。这些发现提示精液微生物组与精子质量存在潜在关系，但需进一步研究确定功能与因果关系。未来研究应结合鸟枪法宏基因组测序、扩大样本量并涵盖多个猪品种，以开发基于微生物组干预改善低质量精液繁殖性能的新策略。
