《Biomaterials》：High-resolution fabrication of porous microtubular scaffolds for vascular tissue engineering using two-photon stereolithography
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Johanna Vetter|Anna Fritschen|Laura Teppe|Souraj Mandal|Nadya Abbood|Alina Filatova|Vijay K. Singh|Regine von Klitzing|Andreas Hecker|Veroni
Johanna Vetter|Anna Fritschen|Laura Teppe|Souraj Mandal|Nadya Abbood|Alina Filatova|Vijay K. Singh|Regine von Klitzing|Andreas Hecker|Veronika Grau|Katrin Richter|Ulrike A. Nuber|Andreas Blaeser
德国达姆施塔特工业大学生物医学打印技术研究所，达姆施塔特，德国
摘要
在组织工程中，为宏观组织提供氧气和营养物质输送途径仍是一项重大挑战。在可用于构建可灌注微管结构的制造方法中，双光子立体光刻技术因其卓越的分辨率而脱颖而出，能够实现毛细血管级别的精细结构。本研究利用双光子立体光刻技术制造中空管，并探究其在体外组织模型中作为微管输送结构的可行性。通过优化参数，使用两种光敏树脂IP-S和IP-Visio打印出了直径从8微米到2毫米、孔径为1到50微米的多种尺寸的多孔中空管。相比IP-Visio，IP-S具有更好的打印性能和更高的形状精度。IP-Visio打印出的结构可与荧光显微镜兼容，而IP-S则会产生强烈的自荧光，干扰荧光成像。这些打印出的结构在平面和多孔曲面上的接触角均在71°到76°之间，表现出部分润湿性，且没有任何液体能够透过孔隙。带有孔隙的打印中空管被集成到灌注系统中，在生理流速条件下，研究了4、70和150千道尔顿大小的分子向周围水凝胶基质的渗透情况。使用这两种光敏树脂打印出的结构都能促进原始人类内皮细胞在平面打印物表面以及打印管内部的附着与存活，细胞存活率均不低于97%。最后，还在细胞因子释放实验中对平面打印物进行了测试，结果显示它们不会引发人类巨噬细胞和单核细胞的促炎或抗炎反应。
引言
三维细胞培养技术为在生理相关环境中进行疾病建模和药物测试提供了极具前景的平台[1]、[2]、[3]、[4]。近年来，人们开发出了多种类型的三维细胞培养体系，包括球状体[5]、类器官[6]以及芯片上的器官装置[7]。然而，尽管已有大量研究，这类模型的血管化问题至今仍未解决，这限制了它们的大小和生物功能。
在体内环境中，直径从几微米到几厘米不等的层级化血管网络[8]、[9]能够实现氧气、二氧化碳、营养物质及代谢物的运输[10]。近年来，人们探索了多种方法在体外重现这种血管结构，包括通过内皮细胞的自组织形成毛细血管系统、生物制造仿生血管通道，以及创建人工类血管导管[7]。第一种方法利用内皮细胞固有的自组装能力，使其能够形成微血管结构[11]、[12]。虽然这一现象已被多次证实[13]，但自组装血管的形成过程耗时较长，需要数天的培养时间，因此无法在三维细胞培养开始时就实现氧气和营养物质的供应。不过，这种方法可应用于规模较小或较薄的二维细胞培养体系[13]，或是用于正在生长的组织。第二种策略则是自上而下地构建模仿血管形态和组织的结构。其制造方法包括在芯轴周围浇注水凝胶[14]、[15]或构建更复杂的结构[16]，以及通过3D生物打印技术制造中空[17]、[18]或牺牲型[19]、[20]网络结构。虽然水凝胶浇注技术已能实现尺寸达6微米的结构[21]，但其应用通常局限于简单几何形状和固定直径的结构。牺牲型打印和3D生物打印技术虽然具备更高的几何灵活性，但在可实现的特征分辨率方面仍存在局限，有研究显示其最大直径约为70微米[22]。最后，人工设计的结构还可以通过引入内皮细胞来转化为人工类血管导管[23]、[24]、[25]。这种方法的优点在于可以利用多种材料和技术来实现不同的功能，这些材料的物理化学性质（如弹性、降解行为）以及细胞生物学特性都具有很高的可塑性。根据不同的制造工艺，还可以调整结构的机械强度、表面形貌和孔隙率。然而，尽管这些人工血管具有诸多优势，但仍存在一些缺陷，限制了其在三维组织模型中的应用，比如所用聚合物可能具有毒性，或者存在未交联的聚合物残留物，其生物功能低于天然组织，而且壁层的扩散性较低甚至不存在。如果要将这类人工血管用于体内实验，其合成组分的免疫相容性也是一个重要考量因素。要解决这些问题，就需要结合高精度的制造工艺以及对界面进行生物功能化处理。
在这种背景下，3D打印技术近年来逐渐成为制造支架的热门选择。与传统的光刻或浇注工艺相比，3D打印无需模板或模具，就能制造出形状复杂的结构[26]、[27]、[28]。在制造人工类血管导管的领域，双光子立体光刻技术尤为突出。这是一种基于双光子聚合原理的3D微制造技术，光敏树脂的聚合仅发生在光引发剂同时吸收两个光子的区域[29]、[30]。这样一来，聚合反应仅发生在激光聚焦的狭小区域内，这一设计有两个优点：首先，由于两个光子几乎同时到达同一位置的随机概率极低，所以该区域的尺寸相对较小，从而实现了纳米级的分辨率[31]、[32]；其次，激光照射范围内的其他树脂区域不会发生交联，因此可以在树脂内部直接构建复杂的独立3D结构。综上所述，双光子立体光刻技术非常适合制造尺寸在几微米到几厘米之间的中空、可灌注结构，甚至是类血管网络。由于其高分辨率，能够精确地制造出微米级厚度的壁层，还能在这些结构上添加尺寸可调节的孔隙。这样制造出的通道结构后续可以经过内皮细胞覆盖，从而用作可灌注的微管支架。其中的孔隙有助于呼吸气体、营养物质和代谢物的扩散交换。此外，较大的孔隙还有助于内皮细胞外渗，进而促进血管生成，使新的血管在周围的细胞外基质中形成。
双光子立体光刻技术已被用于在多种生物环境中制造模拟血管的微管结构，比如用于内皮细胞和胶质母细胞瘤细胞共培养的微血管通道[33]、[34]，用于提升脑类器官中营养物质扩散效率的相互连接的血管结构[35]，以及完整的微流控血脑屏障模型[36]、[37]。此外，该技术还被用来打印作为机械支撑的血管移植物[38]。目前所描述的研究主要侧重于双光子立体光刻技术在生物领域的应用，但该打印技术本身以及作为微管支架的双光子立体光刻打印结构所具有的细胞生物学效应尚未得到深入研究。
在我们的研究中，我们利用双光子立体光刻技术制造了多孔管状结构，并评估了它们作为可灌注微管支架的适用性。我们对两种市售的丙烯酸类光敏树脂的打印参数进行了优化，重点考虑了它们的光学可加工性、表面形貌和润湿性。此外，我们还研究了这些树脂与水凝胶以及活细胞的相互作用。同时，我们分析了通道内的流体流动特性以及分子通过孔隙的扩散传输情况。最后，我们通过使用人类巨噬细胞和单核细胞进行细胞因子释放试验，研究了双光子立体光刻打印结构可能产生的促炎或抗炎效应。
章节节选
为制造微管结构而对双光子立体光刻参数的优化
我们使用两种光敏树脂IP-S和IP-Visio，通过双光子立体光刻技术制造了多孔管状支架。IP-S广泛用于微光学领域[39]、[40]、[41]，以及微针制造[42]、[43]、[44]，还有微流控技术领域[35]、[45]、[46]、[47]，它具有较高的结构稳定性和精度[48]、[49]。IP-Visio则是为无荧光成像而开发的，它的成分与IP-S不同，因此需要不同的加工流程。为了确定最佳的打印条件，我们研究了激光功率、扫描速度、切片距离等因素的影响，
结论
本研究表明，双光子立体光刻技术是一种非常适合制造与天然血管尺寸相近的人工可灌注微管支架的高精度技术。本研究的一个重要内容就是对双光子立体光刻工艺本身进行优化，确定了其中最具影响力的参数，包括激光功率、扫描速度、刻蚀距离以及切片距离。这些经过优化的参数对于确保打印出的结构的精度和机械性能至关重要。
打印流程
所有的双光子立体光刻打印工作都是在Nanoscribe Professional GT2系统上完成的，该系统由德国卡尔斯鲁厄的Nanoscribe公司生产，配备了3D Microfabrication Solution Set Medium Features功能模块，该模块使用了Carl Zeiss公司生产的LCI Plan-Neofluar 25×/0.8 Imm Corr DIC M27物镜（德国奥伯科亨）。该系统采用波长为780纳米的飞秒级光纤激光器，脉冲持续时间在80飞秒到100飞秒之间，重复频率为80兆赫兹。在100%的激光功率下，该系统的输出功率经校准为50毫瓦。
CRediT作者贡献说明
Nadya Abbood：论文撰写——初稿撰写，可视化处理，方法设计，实验研究，正式分析。 Souraj Mandal：论文撰写——初稿撰写，方法设计，实验研究，数据整理。 Vijay K. Singh：资源协调，方法设计，实验研究，正式分析。 Alina Filatova：论文撰写——审阅与编辑，论文撰写——初稿撰写，方法设计，数据整理。 Regine von Klitzing：论文撰写——审阅与编辑，项目监督，资源协调，项目管理工作。 Veronika Grau：论文撰写——审阅与编辑，
资金支持
我们衷心感谢德国黑森州资助的LOEWE研究计划网络（属于FlowForLife研究集群，项目编号为LOEWE/2/14/519/03/07.011(0002)/78）提供的资金支持。Katrin Richter则获得了德国研究基金会（DFG，即德国研究基金会）的资助，其项目编号分别为515250365和528562393-FIP 26。
利益冲突声明
? 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。
致谢
作者们要感谢达姆施塔特工业大学的Valentina Missano和Philipp Richthof，以及吉森大学的Gabriele Fuchs-Moll、Sabine Stumpf和Simone Schwalm，他们为研究提供了出色的技术支持。此外，作者们还要感谢Annabelle Neuh?usler和Enis Musa Saritas在扫描电子显微镜成像方面的帮助，同时也要感谢Alexander Schie?er和Selina Finn在液相色谱-质谱分析中的支持。
