DENND2D是与低级别胶质瘤不良预后及肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）相关的新型生物标志物

《IBRO Neuroscience Reports》：DENND2D is a novel biomarker associated with poor prognosis in low-grade gliomas and tumor-associated macrophages (TAMs)

　　

背景

DENND2D作为DENND2家族的关键成员，在多种疾病的发病机制与进展中发挥重要作用，包括高级别胶质瘤、结肠癌、膀胱癌和脓毒症。然而，其在低级别胶质瘤（LGG）中的功能仍不明确。

方法

本研究利用癌症基因组图谱（TCGA）、中国胶质瘤基因组图谱（CGGA）和基因型-组织表达（GTEx）数据库，系统评估了DENND2D在多种肿瘤中的表达差异及其预后价值。随后，进一步开展整合分析，以评估DENND2D表达与LGG临床特征、预后、生物学功能、免疫微环境及遗传改变之间的关联。同时，研究人员进行了体外和体内实验，以探讨DENND2D在LGG中的具体作用。

结果

DENND2D在大多数肿瘤中呈显著上调表达，并且在LGG中与不良预后密切相关，可作为LGG患者的独立预后生物标志物。其在LGG中的表达与免疫检查点基因（ICGs）、免疫微环境、M2型巨噬细胞浸润以及肿瘤突变负荷（TMB）密切相关。功能实验表明，DENND2D在调控细胞活性、增殖和迁移方面具有关键作用，从而在体外和体内共同促进肿瘤进展。

结论

DENND2D是影响LGG患者临床预后的重要因素，并且是一个潜在的治疗靶点。

本文发表于《IBRO Neuroscience Reports》，围绕DENND2D在低级别胶质瘤（LGG）中的表达特征、预后价值、免疫学关联及功能作用展开系统研究。研究背景在于，胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤，尽管LGG较高级别胶质瘤生存期相对更长，但其复发率高、易发生恶性进展，最终仍可转化为高级别胶质瘤并导致不良结局。因此，寻找能够反映LGG恶性进展、预后分层和潜在治疗价值的分子标志物具有重要意义。DENND2D属于DENN结构域蛋白家族成员，与Rab信号通路激活、膜转运及胞内信号调控相关。既往研究已提示其在不同疾病和肿瘤中的作用具有明显组织特异性与情境依赖性：在某些实体瘤中表现为抑癌基因，而在胶质瘤中则可能具有不同的生物学效应。然而，DENND2D在LGG中的临床意义及分子功能此前尚未被系统阐明，这构成了本研究开展的直接原因。

研究人员首先通过TCGA、CGGA和GTEx数据库，系统分析DENND2D在泛癌范围内的表达与生存关联，并重点聚焦LGG队列，评估其与临床病理参数、免疫检查点基因（ICGs）、肿瘤微环境（TME）、免疫浸润、肿瘤突变负荷（TMB）以及基因突变图谱之间的关系；随后结合体外细胞学实验和体内裸鼠颅内移植瘤模型，对DENND2D在LGG中的促瘤作用进行验证。研究最终得出结论：DENND2D在LGG中高表达，且与较差预后密切相关，是LGG患者独立预后因素；其表达与免疫抑制相关表型、尤其是M2型巨噬细胞浸润显著相关；功能上，DENND2D促进胶质瘤细胞活性、增殖、迁移和侵袭，并推动体内肿瘤生长。该研究的重要意义在于提出DENND2D可作为LGG的潜在预后生物标志物与治疗靶点，并为理解LGG免疫微环境调控提供了新的分子线索。

在技术方法方面，研究主要采用以下策略：基于TCGA、CGGA-325、CGGA-693及GTEx队列开展转录组与临床资料整合分析，其中LGG纳入样本分别为TCGA 499例、CGGA-325 146例、CGGA-693 257例；通过Kaplan-Meier生存分析、ROC曲线和Cox回归评估预后价值；利用GSVA、GO和KEGG分析功能通路；采用CIBERSORT与ESTIMATE算法评估免疫细胞浸润和基质/免疫评分；结合TMB、MSI和拷贝数改变（CNA）分析遗传学特征；并在SW1088细胞及裸鼠颅内移植瘤模型中，借助qRT-PCR、CCK-8、克隆形成、Transwell、划痕愈合及活体生物发光成像进行功能验证。

在研究结果部分，论文按照多个子部分展开。首先是“Pan-Cancer Analysis of DENND2D”。该部分基于TCGA和GTEx比较了33种肿瘤与正常组织中的DENND2D表达差异，发现DENND2D在包括LGG、GBM、乳腺癌、肺腺癌、胰腺癌和结直肠癌等在内的20种肿瘤中上调，而在肾上腺皮质癌、肺鳞癌、黑色素瘤、肝细胞癌等部分肿瘤中下调。进一步进行单因素Cox及生存分析后发现，高DENND2D表达与LGG和GBM患者较短的总生存期（OS）、疾病特异性生存期（DSS）和无病间期（DFI）相关，其中LGG中的不良预后关联尤为显著。此外，泛癌分析还提示DENND2D与多种ICGs共表达，并与微卫星不稳定性（MSI）和TMB在部分癌种中存在相关性，说明其可能参与肿瘤免疫调控和基因组不稳定性相关过程。

其次是“DENND2D as an Independent Prognostic Factor in LGG”。这一部分利用TCGA、CGGA-325和CGGA-693三个LGG独立队列，系统评估DENND2D的临床相关性和预后效能。结果显示，DENND2D高表达与年龄>45岁、更高WHO分级、IDH突变状态、1p/19q非共缺失状态及MGMT启动子非甲基化状态显著相关。生存分析表明，高DENND2D表达患者生存时间更短、死亡率更高；ROC分析提示其对1年、3年和5年OS具有一定预测能力；单因素和多因素Cox回归进一步证实，DENND2D是LGG患者独立预后因素。该部分说明DENND2D不仅与肿瘤恶性生物学表型相关，而且具备实际的临床分层价值。

第三部分为“Association of DENND2D with ICGs”。研究人员在三个LGG队列中分析DENND2D与25个免疫检查点基因的共表达关系，发现DENND2D与大多数ICGs呈显著正相关。尤其是与CD274、CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1和TIGIT等经典免疫检查点分子在三个队列中均保持稳定正相关。这一结果表明，DENND2D高表达可能与免疫检查点通路激活相关，提示其可能参与LGG免疫逃逸形成。

第四部分实际上结合了通路富集与差异基因分析。GSVA结果显示，在TCGA、CGGA-325和CGGA-693三个数据集中，DENND2D高表达均与细胞周期进程、DNA复制、有丝分裂、p53信号通路以及肿瘤微环境形成和转移相关通路密切相关；IL6-JAK-STAT3信号、干扰素-γ反应和同种移植排斥等通路也呈富集。进一步依据DENND2D高低表达筛选差异表达基因后，GO分析显示这些基因主要涉及T细胞活化调控、膜电位调控、白细胞分化以及淋巴细胞/白细胞细胞间黏附等免疫相关过程；KEGG分析则富集于吞噬体、金黄色葡萄球菌感染、1型糖尿病、病毒性心肌炎和结核病等通路。该结果提示，DENND2D相关分子网络与细胞增殖程序及免疫应答通路均有密切联系。

第五部分为“DENND2D Correlates with Immunophenotypes in LGG”。研究人员借助ESTIMATE算法发现，DENND2D表达与基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分均呈正相关，提示其与较低肿瘤纯度及更复杂的肿瘤微环境相关。CIBERSORT分析进一步显示，在DENND2D高表达LGG中，CD4⁺初始T细胞、静息记忆CD4⁺T细胞、活化记忆CD4⁺T细胞、M1巨噬细胞和M2巨噬细胞浸润更显著。更关键的是，DENND2D与M2型巨噬细胞标志基因TGFB1、IL10、CD163和CSF1R显著正相关，且其与M2巨噬细胞的联系强于M1巨噬细胞。Kaplan-Meier分析还显示，在M2巨噬细胞高浸润背景下，DENND2D高表达患者预后最差。这部分结果强化了DENND2D与肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）特别是免疫抑制性M2型表型之间的关联。

第六部分为“DENND2D Expression and Genomic Variations in LGG”。研究显示，LGG中最常见突变基因为IDH1，其后依次为TP53、ATRX和CIC，且错义突变最常见。DENND2D表达与TMB呈正相关；同时，TMB与年龄、DENND2D表达、1p/19q共缺失状态、肿瘤分级和IDH突变状态显著相关。预后分析进一步表明，TMB越高，LGG患者临床结局越差；当高DENND2D表达与高TMB并存时，患者预后最差。该部分提示DENND2D可能与LGG的基因组改变负荷及恶性进展风险相关。

第七部分为“Functional Validation of DENND2D in LGG Models”。在SW1088低级别胶质瘤细胞中，研究人员构建DENND2D敲低和过表达模型。CCK-8结果显示，敲低DENND2D后细胞活性下降；Transwell实验表明侵袭能力减弱；克隆形成和划痕愈合实验显示细胞增殖与迁移能力受到显著抑制。相反，DENND2D过表达则增强细胞活性、克隆形成、迁移和侵袭。体内方面，研究人员采用表达荧光素酶的U251细胞构建裸鼠颅内肿瘤模型，结果发现DENND2D敲低组肿瘤生物发光信号减弱、总光子通量降低、肿瘤生长减缓，且荷瘤鼠生存率升高、体重下降较轻。该部分从体外和体内两个层面验证了DENND2D的促肿瘤作用。

讨论部分强调，本研究基于多队列多组学数据并结合实验验证，首次系统刻画了DENND2D在LGG中的表达模式、预后意义和生物学功能。研究证明，DENND2D不仅是LGG独立预后因子，还与免疫检查点激活、TME重塑、M1/M2巨噬细胞浸润以及TMB升高密切相关，提示其可能参与LGG免疫调控和恶性进展。富集分析进一步支持DENND2D与细胞周期、DNA复制、有丝分裂、p53信号通路及肿瘤微环境重塑相关。作者同时指出研究局限：研究对象限于LGG；DENND2D介导上述过程的分子机制仍待深入阐明；动物实验采用裸鼠异种移植模型，尚不能完全反映完整免疫微环境。总体而言，论文通过数据库分析与实验验证相结合，较为完整地建立了DENND2D在LGG中的临床和生物学图谱。

研究结论可译为：DENND2D是影响LGG患者临床预后的重要因素，也是一个潜在的治疗靶点。