综述：解析动态植物互作网络：从体外实验到体内定量研究方法

《Plant Methods》：Mapping the dynamic plant interactome: from in vitro assays to in vivo quantitative approaches

　　

摘要

背景

在植物中，几乎所有的生物过程都依赖于蛋白质-蛋白质相互作用，从信号转导和免疫反应到生长发育以及应对胁迫。尽管这类相互作用具有至关重要的意义，但植物的互作网络仍远未完整，现有的图谱也因传统检测技术的内在局限而存在系统性偏差。

主要内容

本综述系统地回顾了蛋白质-蛋白质相互作用研究方法的演变历程，从基础方法到先进的体内及定量检测平台。诸如酵母双杂交系统和体外pull-down实验之类的传统技术是在非生理细胞环境中进行的，难以捕捉短暂或条件依赖性的相互作用。亲和纯化结合质谱技术虽能提高检测效率，但仍易受到细胞裂解过程中产生的干扰，以及弱相互作用蛋白更容易丢失的问题影响。为解决这些缺陷，利用工程化的生物素连接酶进行邻近标记技术应运而生，尤其是作用快速的TurboID变体，它能够在细胞裂解前对活细胞内的蛋白质邻域进行共价生物素化，从而保留传统方法常常忽略的相互作用。由于TurboID反映的是蛋白质间的邻近关系而非直接结合，其结果需要后续的二元验证。此外，用于进一步研究的互补性体内验证工具同样不可或缺。基于NanoLuciferase报告基因的分裂荧光素酶互补实验能够在天然表达条件下高灵敏度地检测二元相互作用，而通过荧光寿命成像显微镜检测的福斯特共振能量转移则能为内源表达水平下的分子邻近关系提供定量的生物物理证据，是一种可靠性极高的验证方法。包括高通量蛋白质微阵列和光遗传学控制的二聚化系统在内的新兴技术，进一步丰富了植物生物学领域可用的研究方法。

结论

我们提出了一种实用且整合性的三级框架，即利用邻近标记技术进行广泛的体内相互作用发现，通过分裂荧光素酶互补实验进行高灵敏度的二元验证，再借助荧光寿命成像显微镜进行定量确认，从而将潜在的相互作用从最初识别逐步引导至经过严格生理学验证的阶段。该框架将现有最佳实践整合为一个结构化的工作流程，适用于绘制动态的植物互作网络，不过其最佳应用方式还需根据具体的生物学问题、目标蛋白类型以及可用资源来决定。