由ISG15介导的PCNA修饰在猪δ冠状病毒感染中发挥关键作用

《Veterinary Research》：Modification of PCNA by ISG15 plays a crucial role in porcine deltacoronavirus infection

　　

猪δ冠状病毒（PDCoV）是一种属于δ冠状病毒属的新兴肠道致病性冠状病毒，已给畜牧业造成巨大损失，并存在跨种传播的潜在风险。干扰素刺激基因15（ISG15）通过与细胞蛋白和病毒蛋白的相互作用，在病毒感染和免疫调节中发挥关键作用。然而，ISG15影响PDCoV感染的机制尚不明确。在本研究中，研究人员证明，由CRISPR-Cas9介导的ISG15敲除促进了PDCoV复制，而ISG15修饰（ISGylation）缺陷削弱了ISG15的抗病毒能力。为阐明PDCoV感染期间ISG15的新作用，研究人员构建了稳定的ISG15过表达IPEC-J2细胞系。研究人员采用串联亲和纯化结合质谱分析（TAP-LC-MS/MS）对ISG15进行分析，鉴定了538个已知和新的候选ISGylation蛋白，其中包括增殖细胞核抗原（PCNA）——一种DNA损伤标志物。研究人员发现PCNA的ISGylation显著抑制了PDCoV复制。在PDCoV感染期间，ISG15 E3连接酶HERC5与PCNA相互作用并促进其ISGylation，而USP18最终对PCNA进行去ISGylation。研究结果不仅揭示了ISGylation作为PCNA的一种翻译后修饰，还阐明了PDCoV感染期间PCNA中ISGylation的功能，从而为病毒-宿主相互作用界面增加了新的复杂性层次。

**论文解读：ISG15介导的PCNA修饰在猪δ冠状病毒感染中的关键作用**

**研究背景与问题**

猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）属于δ冠状病毒属，是一种新发肠道致病性冠状病毒，主要感染哺乳仔猪，引起严重腹泻、呕吐和脱水，给全球养猪业造成重大经济损失。PDCoV于2012年首次在香港发现，2014年在美国被确认，其后在多个国家流行。该病毒具有跨种传播的潜在风险，对公共卫生安全构成威胁。

干扰素刺激基因15（Interferon-stimulated gene 15，ISG15）是一种由I型干扰素诱导的类泛素蛋白，可通过共价修饰（ISGylation）调控宿主抗病毒免疫。ISG15修饰由E1酶（Ube1L）、E2酶（UbcH8）和E3连接酶（如HERC5、HERC6、EFP、ARIH1）催化，且可被去ISG化酶（如USP18、USP10）逆转。尽管已知ISG15在多种病毒感染中发挥抗病毒作用，但其影响PDCoV复制的具体机制尚不明确。此外，PDCoV编码的PLpro蛋白酶具有去泛素化和去ISG化活性，可能通过拮抗ISG15功能逃逸宿主免疫。因此，鉴定PDCoV感染中ISG15修饰的宿主靶蛋白，对理解宿主抗病毒分子机制至关重要。

**研究内容与结论**

本研究系统阐明了ISG15通过ISGylation抑制PDCoV复制的机制，并鉴定了关键靶蛋白增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）。研究人员通过CRISPR-Cas9敲除ISG15、过表达ISG15及其功能突变体、串联亲和纯化-质谱鉴定、体外ISG化实验、免疫共沉淀和病毒滴度测定等多种方法，证明PCNA的ISGylation由E3连接酶HERC5催化、USP18去ISG化，并显著抑制PDCoV复制。研究结果揭示了病毒-宿主互作的新层面，为开发抗PDCoV策略提供了理论依据。该论文发表在《Veterinary Research》。

**关键技术方法**

1. **CRISPR-Cas9基因敲除**：设计靶向猪ISG15的sgRNA，构建慢病毒载体，转导IPEC-J2细胞（猪肠上皮细胞系），经嘌呤霉素筛选获得ISG15敲除单克隆细胞系（IPEC-J2-ISG15-KO）。
2. **慢病毒介导的稳定过表达**：将Flag-His双标签融合的猪ISG15基因克隆至CMV慢病毒载体，包装慢病毒后以MOI=1感染IPEC-J2细胞，获得稳定表达ISG15的细胞系（CMV-ISG15）。
3. **串联亲和纯化-液相色谱-串联质谱（TAP-LC-MS/MS）**：利用His-Flag双标签进行两步亲和纯化，从PDCoV感染和未感染的CMV-ISG15细胞裂解液中富集ISG15结合蛋白，经质谱鉴定共获得538个候选ISGylation蛋白。
4. **体外ISG化实验（In vitro ISGylation assay）**：共转染E1（UBE1L）、E2（UbcH8）、E3（HERC5）及ISG15或突变体ISG15AA，通过Western blot检测ISGylation水平。
5. **免疫共沉淀（co-IP）和Pull-down**：利用抗HA、Myc、Flag等标签抗体进行IP，或通过Ni-NTA树脂拉下HisMax-PCNA及其突变体，验证蛋白互作和ISGylation位点。

**研究结果**

**1. 猪ISG15蛋白表达在PDCoV感染后上调**
研究人员用不同剂量PDCoV感染IPEC-J2细胞，12和24 hpi时ISG15蛋白表达显著升高。紫外线灭活病毒后无法诱导ISG15上调，表明该上调依赖于病毒复制。

**2. ISG15在猪细胞系中广泛表达**
Western blot检测了ST（猪睾丸细胞）、3D4/21（猪肺泡巨噬细胞）、IPEC-J2、PK-15（猪肾细胞）和LLC-PK1（猪肾细胞）中猪ISG15的表达，结果显示ISG15在多种组织来源细胞中均有较高水平表达。

**3. ISG15抑制PDCoV增殖**
在IPEC-J2细胞中瞬时转染不同剂量pCAGGS-ISG15，与空载体对照相比，PDCoV M基因mRNA水平、N蛋白水平和培养上清病毒滴度（TCID₅₀/mL）在12和24 hpi均显著降低。

**4. CRISPR-Cas9介导的ISG15敲除促进PDCoV复制**
成功构建IPEC-J2-ISG15-KO细胞系，Western blot确认ISG15蛋白缺失。与野生型IPEC-J2相比，敲除细胞在PDCoV感染12和24 hpi后，病毒mRNA、N蛋白和病毒滴度均显著升高。

**5. ISGylation参与ISG15抗PDCoV活性**
通过定点突变构建ISG15 C端LRLRGG→LRLRAA突变体（ISG15AA），该突变体失去ISGylation能力。转染ISG15GG（野生型）或ISG15AA后，ISG15AA组的ISGylation水平下降，且对PDCoV mRNA和病毒滴度的抑制效果显著弱于ISG15GG组，在IPEC-J2-ISG15-KO细胞中结果一致，表明ISG15的抗病毒作用依赖ISGylation。

**6. 在IPEC-J2中稳定表达His-Flag-ISG15融合蛋白**
通过慢病毒包装建立CMV-ISG15稳定细胞系，EGFP报告基因显示转导成功，细胞活力未受影响。ISG15 mRNA和蛋白显著升高，且仅过表达ISG15即可诱导ISGylation，无需共转染其他酶或IFN预处理，适合用于后续筛选。

**7. 利用TAP-LC-MS/MS鉴定ISG15相互作用蛋白**
从PDCoV感染和未感染的CMV-ISG15细胞中纯化ISG15-蛋白复合物，排除两组共同鉴定的185种蛋白后，在未感染组获得141种、感染组获得212种候选互作蛋白。经筛选得到30个ISG15共价结合蛋白，其中PCNA、IQGAP1和filamin-B isoform 2为已知ISG15互作蛋白。GO分析显示氧化还原过程和翻译途径显著富集，感染组中RNA识别基序、中间丝蛋白等结构域显著富集。

**8. ISG15通过共价结合PCNA抑制PDCoV复制**
PCNA过表达显著提高PDCoV病毒滴度和N蛋白水平，而PCNA抑制剂PCNAI1可抑制病毒复制。PDCoV感染促进PCNA从细胞核向细胞质转移，并上调PCNA和γH2AX（另一DNA损伤标志物）表达。利用PCNA K168R突变体（已知ISGylation关键位点）发现，野生型PCNA可逆转ISG15过表达引起的病毒抑制，而K168R突变体无效。Pull-down实验证实K168是猪PCNA的主要ISGylation位点。PCNA与USP18相互作用，过表达USP18可去除PCNA的ISG化修饰。

**9. HERC5通过催化PCNA ISGylation增强ISG15抗病毒活性**
免疫共沉淀显示PCNA与HERC5存在明显互作。利用shRNA敲低HERC5后，IFN-α预处理或ISG15过表达对PDCoV的抑制作用显著减弱。构建HERC5酶活突变体C994A（HECT结构域Cys994→Ala），该突变体无法增强PCNA的ISGylation，表明HERC5作为ISG15 E3连接酶催化PCNA ISGylation。

**总结讨论与结论**

本研究证明ISG15在猪细胞中广泛表达，并通过ISGylation抑制PDCoV复制。CRISPR-Cas9敲除ISG15可增强病毒复制，而ISGylation缺陷突变体丧失抗病毒活性。利用TAP-LC-MS/MS鉴定出538个候选ISGylation蛋白，其中PCNA作为DNA损伤标志物被重点关注。PCNA促进PDCoV复制，PDCoV感染诱导PCNA核质转移和DNA损伤。PCNA的ISGylation由E3连接酶HERC5催化（依赖其Cys994残基），且可被USP18去除。研究结论（翻译自原文摘要）：”研究结果不仅揭示了ISGylation作为PCNA的一种翻译后修饰，还阐明了PDCoV感染期间PCNA中ISGylation的功能，从而为病毒-宿主相互作用界面增加了新的复杂性层次。“ 这一发现为理解ISG15抗RNA病毒机制提供了新视角，并为开发针对PDCoV的干预策略奠定了分子基础。