负载Fe3+/AMP纳米酶的可注射壳寡糖-透明质酸水凝胶通过促进ROS清除与免疫调节实现心肌梗死修复

《Journal of Advanced Research》：Injectable Chito-oligosaccharide-hyaluronic acid hydrogels with Fe3+/AMP nano-enzyme promote ROS scavenging and immunomodulation for myocardial infarction repair

　　

心肌梗死后以氧化应激、缺氧及炎症失衡为主导的微环境，严重限制了心脏再生。现有用于心肌梗死（MI）治疗的可注射水凝胶很少能够同时应对这些因素，而过度清除活性氧（ROS）反而可能悖论性地导致氧化损伤。

本研究旨在开发一种可注射水凝胶，该水凝胶能够在不诱发氧化损伤的前提下，同时实现ROS清除、持续释氧以及免疫反应调节。

研究人员合成了壳聚糖寡糖-透明质酸水凝胶（C-COS-OHA），并引入温和型Fe³⁺/腺苷单磷酸（AMP）纳米酶，以实现氧生成和氧化还原稳定性。羧基修饰壳聚糖寡糖（C-COS）被设计用于促进M2型巨噬细胞极化。研究人员在体外评价了该水凝胶对氧化应激的保护作用及耐缺氧能力，并在MI小鼠模型中评估了其氧滞留、炎症调节及心脏修复效果。

与负载过氧化氢酶（CAT）的水凝胶相比，C-COS-OHA-Fe³⁺/AMP在氧化应激条件下使人脐静脉内皮细胞（HUVECs）存活率提高28.9%，并在缺氧条件下使划痕闭合加快26.9%。体内实验中，光声成像证实其具有延长的氧滞留能力；实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）显示转化生长因子-β（TGF-β）表达升高4.1倍。治疗28天后，MI小鼠纤维化降低49%，心室壁厚增加37%，左心室射血分数（LVEF）改善至58.3 ± 3.1%，且上述指标均优于C-COS-OHA-CAT组。

C-COS-OHA-Fe³⁺/AMP水凝胶将ROS清除、氧调控和免疫调节整合于单一可注射平台中，代表了MI水凝胶由单一机制向综合性微环境调控转变，从而增强心脏再生修复能力。

该研究发表于《Journal of Advanced Research》，围绕心肌梗死后不利微环境的综合干预展开。心肌梗死后，梗死区通常伴随剧烈氧化应激、持续缺氧及炎症反应紊乱，三者相互放大，推动心肌细胞凋亡、纤维化进展和心室重构。尽管当前药物和介入治疗已改善急性期救治效果，但难以有效逆转梗死后局部微环境失衡。近年来，可注射水凝胶因具备细胞外基质（ECM）模拟、高含水性和局部递送优势，成为心肌修复的重要生物材料平台。然而，传统体系多聚焦于单一功能，例如机械支撑、单纯释氧或单一抗氧化，难以同步调控氧化应激、缺氧与免疫失衡；此外，过强的ROS清除或传统CAT介导的氧生成还可能引发氧化反弹等问题。因此，开发一种兼具抗氧化、稳态供氧和免疫调节能力的多功能可注射水凝胶，对于改善梗死后微环境并促进再生修复具有明确必要性。

针对上述问题，研究人员构建了由6-羧基壳聚糖寡糖（C-COS）、氧化透明质酸（OHA）和Fe³⁺/腺苷单磷酸（AMP）纳米酶组成的多功能可注射水凝胶体系。该体系利用C-COS与OHA之间的席夫碱（Schiff base）动态交联形成凝胶骨架，同时借助Fe³⁺/AMP配位聚合物赋予体系温和、可控的类过氧化氢酶样催化性能，使其能够在H₂O₂富集环境中生成O₂并维持氧化还原稳态。研究表明，该水凝胶不仅具有良好的可注射性、自修复性和力学稳定性，还能在体内外有效调控ROS、改善缺氧状态并诱导巨噬细胞向修复型M2样表型转化。最终，研究人员证实，C-COS-OHA-Fe³⁺/AMP在小鼠心肌梗死模型中优于CAT负载体系，能够显著减轻纤维化、保留心室壁厚并改善心功能。该结果说明，这一平台实现了从“单一功能材料递送”向“材料组分本身即具生物活性并协同调控微环境”的策略转变。

研究采用的主要关键技术方法包括：通过核磁共振（¹³C NMR、¹H NMR）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）验证C-COS与OHA化学修饰；以动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、光学相干断层扫描（OCT）及流变学分析评价Fe³⁺/AMP纳米酶和水凝胶理化性质；在HUVECs中开展ROS探针染色、流式细胞术、活/死染色、划痕和成管实验评价抗氧化及促血管生成效应；以C57BL/6J雄性小鼠左前降支永久结扎建立MI模型，并通过光声成像、qRT-PCR、ELISA、免疫荧光、TUNEL、超声心动图和Masson染色评估体内氧代谢、炎症、细胞凋亡、血管生成及心脏修复。

2.1. Synthesis and characterization of C-COS-OHA hydrogels
研究人员首先完成了C-COS和OHA的化学构建。核磁共振结果显示，C-COS和OHA分别出现对应羧基与醛基的新特征信号，FTIR也观察到与–COOH和–CHO相关的特征吸收峰，证明两种前体修饰成功。随后构建Fe³⁺/AMP配位聚合物，其Zeta电位为负值，提示体系具有较好稳定性；DLS和TEM显示纳米酶颗粒呈聚集结构，粒径主要分布于150–200 nm。以此为基础制备了C-COS-OHA、C-COS-OHA-CAT和C-COS-OHA-Fe³⁺/AMP三类水凝胶。FTIR证实凝胶内形成亚胺键，倒置试管实验表明各组均可在2 min内快速凝胶，并可顺利通过注射器，显示良好可注射性。OCT与SEM显示凝胶内部均具有互联多孔结构，其中Fe³⁺/AMP组孔结构更均匀致密。流变学结果显示，各组储能模量（G'）均高于损耗模量（G''），提示稳定成胶；Fe³⁺/AMP组G'最高，说明其交联密度和机械稳定性最强，同时降解最慢。所有水凝胶均表现出显著剪切变稀和应变循环后的快速自修复能力，说明该系列材料适用于动态心肌环境中的局部注射治疗。

2.2. Effect of C-COS-OHA series hydrogels on anti-oxidization and angiogenesis
在体外功能评价中，研究人员首先通过溶血实验、CCK-8和活/死染色验证了材料的生物相容性。随后利用Fenton反应体系、DPPH自由基清除实验和类CAT活性测定分析其抗氧化能力。结果表明，不同配方对不同ROS类型具有差异化清除特征：C-COS-OHA-CAT对羟自由基（·OH）清除最强，C-COS-OHA对有机氧自由基清除更显著，而C-COS-OHA-Fe³⁺/AMP表现出最高类酶活性。进一步在H₂O₂诱导的HUVECs氧化应激模型中，DCFH-DA和DHE荧光染色及流式细胞术均显示，Fe³⁺/AMP组可显著降低细胞内总ROS和超氧阴离子水平，效果接近未诱导对照；而CAT组在细胞内ROS降低方面较为有限。活/死染色和细胞活力测定进一步证明，Fe³⁺/AMP组对氧化应激下细胞存活具有更明显保护作用。

在缺氧相关功能方面，划痕实验显示，Fe³⁺/AMP组在24 h时可获得最高的伤口闭合率，提示其生成氧气后更有利于内皮细胞迁移。成管实验显示，三类水凝胶均能促进HUVECs血管样网络形成，其中C-COS-OHA组在促进血管连接点形成方面最突出。研究人员认为，这可能与该组较快降解释放更多透明质酸等活性成分有关。总体而言，这部分结果说明，Fe³⁺/AMP组在抗氧化保护和缺氧耐受改善方面表现最佳，而基础C-COS-OHA体系也保留了较强的促血管生成潜力。

2.3. Effect of C-COS-OHA series hydrogels on MI mice model
基于体外结果，研究人员在小鼠MI模型中评估了水凝胶的体内疗效。术后第1天和第3天的光声成像显示，所有水凝胶治疗组在梗死前壁均出现较高血氧饱和度信号，其中C-COS-OHA-Fe³⁺/AMP组信号最强且维持时间更长，表明该体系能够在梗死区持续提高氧合水平并保持局部滞留。DHE检测进一步证实，治疗后第3天CAT组和Fe³⁺/AMP组均可显著降低心肌组织ROS水平，提示两类酶组分在急性期均具有抗氧化效果。

在免疫微环境方面，qRT-PCR显示，与PBS组相比，Fe³⁺/AMP组和CAT组均下调M1型巨噬细胞相关标志物TNF-α和iNOS，并上调M2型相关基因Arg1与TGF-β；其中Fe³⁺/AMP组对TGF-β提升尤为明显。ELISA进一步表明Fe³⁺/AMP治疗可降低IL-1β、TNF-α和IL-6水平。免疫荧光结果中，M1标志物CD86信号下降，M2标志物CD206信号升高，支持巨噬细胞向修复型M2样表型转化。TUNEL染色显示，所有水凝胶组均减少梗死区凋亡心肌细胞，且含酶组效果更优，提示其在急性期通过改善氧化与炎症环境间接提高心肌细胞存活。

在中长期修复效果方面，超声心动图于术后14天和28天显示，各水凝胶组均较PBS组改善左心室射血分数（LVEF）、左心室缩短分数（LVFS）并降低左心室收缩末和舒张末内径（LVIDS、LVIDD），其中C-COS-OHA-Fe³⁺/AMP组效果最佳。Masson染色显示，PBS组存在显著胶原沉积和不良左心室重构，而Fe³⁺/AMP组纤维化面积明显降低，左心室壁厚保留最好。定量结果表明，其纤维化水平由53.26%降至26.21%，表现出最显著的抗纤维化作用。进一步的免疫荧光分析显示，Fe³⁺/AMP组c-TnT阳性成熟心肌细胞保留更多，肌节排列更整齐，提示心肌结构完整性更佳；同时vWF和α-SMA染色显示该组毛细血管和小动脉密度增加，说明其具有促进血管重建的作用。

讨论部分显示，该研究的核心价值在于构建了一个可同时调节氧化应激、缺氧和炎症反应的多功能平台。研究结果表明，单纯依赖传统CAT的策略虽然具备一定清除ROS和供氧能力，但持续性和稳态调节不足，而Fe³⁺/AMP纳米酶在温和、pH响应及长期稳定方面更具优势。C-COS作为羧基化壳寡糖，不仅提升了溶解性和抗氧化性能，也与M2样巨噬细胞极化相关；OHA则为凝胶提供高效交联和透明质酸固有的促血管生成、抗炎基础。三者结合后形成的动态交联网络兼具力学支撑、生物活性和持续微环境重塑能力。作者同时指出，目前关于该体系在氧化条件下的降解行为、Smad信号通路、MMP/TIMP平衡、铁死亡（ferroptosis）相关安全性、电生理特征及大动物模型有效性仍需进一步研究，但这些内容属于未来转化方向，而非当前结论的外推。

研究结论部分可概括为：研究人员构建了一种由C-COS、OHA和Fe³⁺/AMP纳米酶组成的可注射自修复水凝胶，用于应对心肌梗死治疗中的复杂病理挑战。该水凝胶通过席夫碱交联形成稳定网络，并借助Fe³⁺/AMP实现pH响应性ROS清除和持续氧生成，从而避免传统CAT系统中失控性高氧和氧化反弹的问题。其治疗作用表现为多阶段过程：早期清除ROS、缓解缺氧，与巨噬细胞向再生性M2表型转化相关，继而促进血管生成并减轻纤维化。体内实验中，Fe³⁺/AMP水凝胶优于CAT对照体系，可显著降低纤维化并恢复心功能。总体而言，该系统将ROS清除、氧调控和免疫调节整合于单一可注射平台，能够将梗死后微环境重编程为有利于再生修复的状态，从而促进心脏结构保存与功能恢复。