《Journal of Advanced Research》：Divergent regulation of DREB1A by ICE1 and ABF4 contributes to distinct cold adaptation in four turfgrass species
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低温限制了草坪草的生长和分布，草坪草分为冷季型和暖季型，具有不同的冷适应能力。然而，不同草种如何进化出独特的冷生存策略仍不清楚。本研究解析了所检测的冷季型和暖季型草坪草之间DREB1A启动子的功能分化，并揭示了调控其不同冷适应策略的潜在转录调控机制。研究人员从
低温限制了草坪草的生长和分布，草坪草分为冷季型和暖季型，具有不同的冷适应能力。然而，不同草种如何进化出独特的冷生存策略仍不清楚。本研究解析了所检测的冷季型和暖季型草坪草之间DREB1A启动子的功能分化，并揭示了调控其不同冷适应策略的潜在转录调控机制。研究人员从四种草坪草中克隆了DREB1A基因，并以不同的启动子-编码序列组合转化水稻、拟南芥野生型和cbfs-1突变体。利用EMSA、Y1H和双荧光素酶检测研究了ICE1和ABF与DREB1A启动子的结合。在cbfs-1突变体中进行的功能互补实验显示，来自两种所检测暖季型草坪草的DREB1A启动子（而非来自两种所检测冷季型物种的启动子）挽救了冷敏感表型。一致地，来自狗牙根的CdDREB1A启动子相比来自高羊茅的FaDREB1A启动子在转基因拟南芥和水稻中赋予更强的耐冷性。机制上，在cbfs-1突变体背景下，AtICE1结合并激活来自所检测暖季型草坪草的DREB1A启动子，但不激活来自两种冷季型物种的启动子。此外，同源检测证实，两种暖季型草坪草的ICE1蛋白直接结合并激活其自身的DREB1A启动子，而所检测冷季型草坪草的ICE1蛋白则不能。进一步，研究人员鉴定了一个新的潜在调控模块LpABF4-LpDREB1A1，该模块似乎正向调控冷季型多年生黑麦草中的冷信号。在多年生黑麦草中过表达LpABF4或LpDREB1A1均显著增强了耐冷性。研究人员的发现支持一个分化模型：所检测的两种暖季型草坪草主要依赖ICE1依赖性DREB1A诱导作为冷避免策略的一部分，而所测试的另外两种冷季型草坪草似乎采用替代性的ABF4-DREB1A1调控模块。研究人员不能排除其他通路也在分化草坪草物种中调控冷胁迫响应的可能性。
**研究背景与问题**
低温胁迫制约草坪草的生长与地理分布。草坪草根据气候适应性分为冷季型（如高羊茅、多年生黑麦草）和暖季型（如狗牙根、结缕草）两类，二者在耐冷能力上存在显著差异。冷季型草坪草通过冷驯化表现出更强的耐冻性，而暖季型草坪草在冬季常进入休眠或遭受冻害。DREB1/CBF（脱水响应元件结合蛋白/C重复结合因子）信号通路是植物冷适应核心机制，其中ICE1（CBF表达诱导因子1）作为关键上游转录因子调控DREB1表达。然而，不同草坪草物种DREB1A启动子的功能分化及其上游转录调控机制（特别是ICE1和ABF（ABA响应元件结合因子）的差异调控）尚不明确。此外，ABA通路是否通过ABF因子参与冷季型草坪草的DREB1A调控也未见报道。本研究旨在解析四种草坪草（两种冷季型：高羊茅、多年生黑麦草；两种暖季型：狗牙根、结缕草）中DREB1A启动子的功能差异，并揭示其上游转录调控机制，以阐明不同冷适应策略的分子基础。
**研究意义**
研究揭示了DREB1A在冷季型和暖季型草坪草中的分化调控模式：暖季型主要依赖ICE1激活DREB1A，而冷季型则依赖ABF4-DREB1A1模块。该发现为理解草坪草冷适应进化机制提供了新视角，并为培育高耐冷草坪草品种提供了分子靶点。论文发表在《Journal of Advanced Research》。
**关键方法**
研究人员从北京绿冠生态科技有限公司获取四种草坪草种子（高羊茅、多年生黑麦草、狗牙根、结缕草），并利用拟南芥（Columbia-0生态型）、水稻（日本晴）及本氏烟进行异源和同源功能验证。主要技术包括：酵母单杂交（Y1H）检测蛋白-DNA结合；电泳迁移率变动分析（EMSA）验证特异性结合；双荧光素酶报告基因检测（Dual-LUC）分析转录激活；转录组测序（RNA-seq）鉴定冷响应基因；基因过表达与功能互补实验（在拟南芥cbfs-1突变体及水稻中）；以及生理指标测定（电解质泄漏、丙二醛含量、活性氧染色及抗氧化酶活性）。
**研究结果**
- **所检测冷季型和暖季型草坪草的DREB1A均增强植物耐冷性**：四种DREB1A基因均受冷胁迫诱导，但暖季型（狗牙根、结缕草）的诱导更迅速（1小时达峰），冷季型（高羊茅、多年生黑麦草）则较晚（3小时达峰）。在拟南芥中过表达CdDREB1A（暖季）和FaDREB1A（冷季）的编码序列均显著提高存活率、降低电解质泄漏和MDA含量，表明DREB1A编码区功能保守。
- **暖季型草坪草DREB1A启动子增强冷响应并挽救cbfs-1冷敏感表型**：将四种草坪草DREB1A启动子分别与AtDREB1A编码序列融合转化拟南芥cbfs-1突变体。冷处理后，暖季型（Cd、Zj）启动子驱动的转基因株系中AtDREB1A表达显著升高，并完全恢复野生型表型；冷季型（Fa、Lp）启动子驱动表达微弱，未能挽救冷敏感表型，电解质泄漏和MDA水平与突变体无显著差异。
- **DREB1A启动子驱动的转基因拟南芥和水稻耐冷性增强**：构建CdDREB1A和FaDREB1A自身启动子及交叉融合载体（CC、CF、FC、FF）转化拟南芥和水稻。在拟南芥中，仅含CdDREB1A启动子（CC、CF）的株系表现出显著耐冷性（高存活率、低电解质泄漏和MDA），而含FaDREB1A启动子（FF、FC）的株系与野生型无差异。在水稻中，CdDREB1A启动子驱动的株系同样表现出更强耐冷性，但FaDREB1A启动子也赋予中等耐冷性（种子萌发率提高），说明其功能具有物种依赖性。
- **组成型过表达而非自身启动子驱动的DREB1A抑制拟南芥生长**：35S启动子驱动的CdDREB1A和FaDREB1A过表达株系出现显著发育缺陷（莲座叶多而小、开花延迟、植株矮化、角果变短）。而自身启动子驱动的株系在提高耐冷性的同时未产生生长异常，表明天然启动子可解除耐冷性与生长抑制的权衡。
- **ICE1功能性地激活两种暖季型而非两种冷季型物种的DREB1A启动子**：酵母单杂交和双荧光素酶检测表明，AtICE1特异性结合并转录激活暖季型（Cd、Zj）DREB1A启动子，而对冷季型（Fa、Lp）无作用。EMSA证实AtICE1直接结合CdDREB1A和ZjDREB1A启动子中的E-box（CANNTG）基序。同源检测中，CdICE1和ZjICE1也直接结合并激活自身DREB1A启动子，而FaICE1和LpICE1则不能。
- **多年生黑麦草冷胁迫转录组分析及LpDREB1A1亚细胞定位**：对多年生黑麦草进行4°C处理0、6、72小时的转录组测序，鉴定出大量差异表达基因（DEGs），GO和KEGG富集显示冷响应、ABA信号、转录调控等相关通路。LpDREB1A1在冷处理后0.5小时即显著上调，且外源ABA可增强其诱导。LpDREB1A1-GFP融合蛋白定位于细胞核。
- **LpDREB1A1增强转基因拟南芥和多年生黑麦草的耐冷性**：在拟南芥中过表达LpDREB1A1显著提高耐冻性，降低电解质泄漏和MDA，并上调冷响应基因（如AtCOR15A、AtCOR15B等）。在多年生黑麦草中过表达LpDREB1A1同样提高分蘖存活率，降低电解质泄漏和MDA，减少活性氧积累，并增强超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性。
- **LpABF4通过激活LpDREB1A1转录增强耐冷性**：LpDREB1A1启动子含有ABRE（ABA响应元件）基序。EMSA、酵母单杂交和双荧光素酶检测一致证明LpABF4直接结合LpDREB1A1启动子并激活其转录。LpABF4受冷胁迫和ABA诱导，定位于细胞核。过表达LpABF4的拟南芥和多年生黑麦草均表现出增强的耐冷性，且LpDREB1A1在LpABF4过表达株系中上调。
**讨论部分总结**
研究提出物种特异性调控网络决定了DREB1A在冷适应中的功能。暖季型DREB1A的快速诱导可能代表应急冷休克反应，而冷季型可能依赖更复杂的非DREB1A通路主导的早期响应。冷季型FaDREB1A启动子在水稻中表现出中等活性，说明其功能非固有缺失，而是受宿主细胞环境调控，凸显启动子功能的物种特异性。天然启动子驱动的DREB1A表达可解偶联耐冷性与生长抑制，为作物改良提供精准策略。ICE1无法结合冷季型DREB1A启动子，可能由于侧翼序列、辅因子需求或存在抑制元件，进化上可能发生了DREB1A调控回路的重新布线。在多年生黑麦草中鉴定出LpABF4-LpDREB1A1模块，该模块可能代表冷季型草坪草特有的ICE1非依赖冷适应机制。LpABF4在干旱热胁迫下抑制LpPLDδ3，而在冷胁迫下激活LpDREB1A1，表现出多效调控作用。
**研究结论翻译**
在本研究中，研究人员鉴定了DREB1A通路转录调控的关键功能分化。在所检测条件下，两种暖季型草坪草的启动子足以完全挽救拟南芥cbfs-1突变体的冷敏感性，并在转基因水稻中赋予稳健的耐冷性，而两种冷季型物种的启动子在异源检测中表现出弱活性或几乎无活性。然而，FaDREB1A启动子在水稻中确实赋予中等耐冷性，表明其功能具有情境依赖性而非绝对无功能。这种观察到的功能差异与ICE1介导的差异反式激活相关：在本研究进行的检测中，ICE1反式激活两种暖季型DREB1A启动子，但不激活两种冷季型物种的启动子。除这一发现外，研究人员还鉴定并表征了一个潜在的LpABF4-LpDREB1A1调控模块，该模块可能参与多年生黑麦草的冷信号传导，为理解冷季型物种的冷适应增加了新的层次。然而，研究人员不能排除其他因子（包括激素和钙）在分化草坪草物种中调控冷胁迫响应的可能性。一个关键的未来方向是确定冷季型和暖季型草坪草的天然ICE1转录因子是否已发生功能分化，这或许能解释物种特异性的启动子选择性。
