单细胞和空间转录组学揭示调控日本血吸虫性发育中细胞分化的关键调节因子

《Advanced Science》：Single-Cell and Spatial Transcriptomics Unveil Key Regulators Governing Cell Differentiation for Schistosoma japonicum Sexual Development

　　

血吸虫病仍然是一个主要的全球健康挑战，主要由于性成熟寄生虫产生大量虫卵所致。然而，调控性发育和产卵的细胞基础及调控程序尚不清楚。在这里，研究人员构建了覆盖性成熟和产卵关键发育阶段的日本血吸虫（S. japonicum）动态单细胞图谱，并首次将其与空间转录组学整合，以绘制组织解析的细胞微环境。通过生物信息学分析和实验验证，研究人员识别了几个驱动寄生虫发育和产卵的关键细胞群体和调控网络。通过将从头鉴定的转录因子（TFs）映射到这些图谱上，研究人员生成了TFs的综合时空表达图谱，并定义了包括Zfp、Fbp3和Lim在内的几个组织特异性TFs的调控程序。整合再聚类进一步揭示并验证了日本血吸虫生殖干细胞分化的关键调节因子。最后，与曼氏血吸虫（S. mansoni）单细胞数据集的比较分析揭示了保守的和物种特异的细胞可塑性，为它们独特的生物学特征提供了前所未有的见解。总体而言，研究人员的综合性研究建立了理解血吸虫生物学的基础资源，破译了细胞分化和致病性背后的调控程序，并加速了识别参与抗血吸虫病性发育的关键分子。

论文解读文章

**研究背景与问题**

血吸虫病是一种影响超过2.5亿人的被忽视的热带病，目前缺乏有效疫苗，仅依赖单一药物吡喹酮（PZQ）进行治疗。血吸虫是雌雄异体的扁形虫，其发育受到严格调控。雄雌配对被认为是配子产生、雌虫性成熟和产卵的必要条件，而产卵是宿主病理和疾病传播的主要驱动力。然而，从幼虫期到性成熟成虫期的动态细胞变化，特别是日本血吸虫中，其细胞基础和调控程序尚未明确。该发育窗口直接关联产卵和病理，但其背后的调控景观基本未知。因此，深入理解寄生虫致病性的关键生物学事件对于发现有效靶点至关重要。

**研究内容与结论**

研究人员利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）系统研究了日本血吸虫三个关键发育阶段（配对前童虫、配对成虫、性成熟成虫）的动态细胞群体。通过生成跨越这些阶段的六个单细胞图谱，并首次整合空间转录组学，他们绘制了组织微环境并定义了细胞定位。研究人员进行了全基因组转录因子（TFs）鉴定，并结合单细胞数据构建了TFs的时空表达图谱。通过实验验证，发现多个TF驱动的程序对性成熟和产卵至关重要。整合再聚类鉴定并验证了生殖干细胞（GSC）分化的关键调节因子。此外，与曼氏血吸虫的跨物种比较揭示了保守和物种特异的细胞特征。这些结果提供了一个公开可用的交互式在线资源。该论文发表在《Advanced Science》，为理解血吸虫生物学提供了基础分子和细胞框架，揭示了致病性相关细胞分化的关键调节因子，并突出了抗血吸虫病的潜在靶点。

**主要关键技术方法**

研究人员采用了以下主要技术方法：（1）使用10× Genomics Chromium平台对来自感染小鼠的日本血吸虫（16、20、26天）进行scRNA-seq，获得单细胞转录组数据；（2）利用Stereo-seq空间转录组学对成虫切片进行分析，获得空间基因表达图谱；（3）通过生物信息学方法（如Seurat、Harmony算法）进行数据整合、聚类和差异表达分析；（4）使用全胚原位杂交（WISH）和荧光原位杂交（FISH）验证细胞类型的解剖定位；（5）通过RNA干扰（RNAi）技术进行基因敲低，结合EdU染色、FastBlue BB染色和透射电子显微镜（TEM）评估细胞增殖、形态及产卵影响；（6）进行酵母双杂交实验验证蛋白互作；（7）与已发表的曼氏血吸虫单细胞数据集进行跨物种比较分析。样本队列来源为感染日本血吸虫尾蚴的BALB/c小鼠和新西兰兔。

**研究结果**

**2.1 日本血吸虫单细胞和空间转录组图谱**

通过scRNA-seq获得60,029个高质量细胞转录组，聚为62个转录上不同的簇，进一步归并为21个生物学注释的细胞类型，涵盖几乎所有已知血吸虫组织。WISH和FISH验证了细胞身份的解剖定位。空间转录组学解析了成虫切片的细胞分布，包括雄性和雌性生殖腺以及配对界面。

**2.2 日本血吸虫性发育过程中的细胞景观**

不同阶段和性别的细胞组成动态变化显著。配对前（D16）两性细胞组成相似。配对后（D20）出现性别特异性生殖细胞。性成熟时（D26），雌虫中生殖和卵黄细胞系显著扩增，同时肌肉、成神经细胞后代和神经元减少；雄虫中体被前体细胞增加。肌细胞和体被细胞显示出性别二态性。例如，C56体被亚群富集于雌虫输卵接口。此外，发现了支持阶段特异性功能的瞬时细胞群。

**2.3 寄生虫性发育过程中的动态细胞转录组**

伪批量分析显示，性成熟雌虫（F26）与未成熟阶段及成熟雄虫存在显著转录差异，而成熟雄虫与未成熟阶段转录相似。模糊聚类解析了2,670个动态基因的八个时间表达模式。特别关注配对时在雄虫中暂时上调的基因簇（簇7），其中NT-3生长因子受体（NT3GFR）介导的酪氨酸激酶通路可能参与该过程。RNAi敲低Nt3gfr损害了睾丸和实质的细胞分化，并影响与其共培养的未处理雌虫的卵黄腺发育和产卵。

**2.4 寄生虫性发育过程中转录因子的时空图谱**

研究人员鉴定了181个转录因子（TFs），并构建了65个动态表达TFs的时空图谱。TFs可组装为三个潜在调控模块。聚焦配对或成熟期峰值表达的16个TFs，分为三组。其中多个TFs显示显著细胞类型特异性，如Zeb2（锌指E-box结合同源框蛋白）特异性表达于卵黄细胞。RNAi敲低Zeb2导致雌虫形态缺陷、卵黄细胞增殖受抑和产卵减少。

**2.5 雄虫生殖腺富集的Zfp⁺和Fbp3⁺细胞调控睾丸发育**

Zfp和Fbp3在雄虫晚期生殖细胞中高表达。RNAi敲低两者均损害睾丸细胞活性，且雄虫中Zfp或Fbp3敲低后与未处理雌虫共培养，导致雌虫卵黄腺发育受损和产卵显著减少。STRING分析提示ZFP可能通过Hedgehog信号通路与RS27ae、POZ等相互作用，酵母双杂交实验证实了ZFP与RS27ae和POZ的互作。

**2.6 雄虫Lim⁺肌细胞影响雌虫发育和产卵**

Lim转录因子在配对后雄虫肌细胞中高表达，特别富集于雄虫抱雌沟体被。RNAi敲低Lim导致雄虫体被肌肉完整性降低。与Lim敲低雄虫共培养的雌虫卵黄腺发育异常且产卵减少。

**2.7 生殖干细胞谱系**

通过再聚类Ago2⁺细胞，鉴定出包括肌肉、神经元、体被等体细胞干细胞以及表达Nanos-1的生殖干细胞（GSCs）。GSCs从童虫到成虫阶段均存在。关键TF（Nanos-1、Bzip、Zfpc2h2）在GSCs和其子代中富集，RNAi抑制这些TF损害睾丸细胞增殖。组蛋白H2A在生殖组织中高表达，RNAi抑制H2A导致雌虫卵巢和卵黄腺细胞增殖减少及产卵降低。

**2.8 血吸虫物种间的细胞可塑性**

整合日本血吸虫和曼氏血吸虫单细胞数据发现，未分化干细胞高度保守（r≥0.80），而终末分化细胞转录分歧显著（r<0.75）。差异表达分析显示，日本血吸虫中GSCs和S1细胞共享上调基因（579个），主要涉及蛋白质泛素化和生物合成，如复制因子、驱动蛋白样蛋白、染色质组装因子1等，这些基因在曼氏血吸虫中几乎检测不到，提示日本血吸虫可能通过转录重编程赋予干细胞超增殖优势，驱动其高繁殖力特性。

**总结讨论与结论**

该研究建立的整合单细胞和空间转录组数据集，解析了日本血吸虫性发育的细胞结构和分子轨迹。研究表明性成熟通过动态细胞重塑协调，GSC分化与雄雌配对紧密相关。雄性多种细胞类型（如Nt3gfr⁺实质/睾丸细胞、Zfp⁺和Fbp3⁺睾丸细胞、Lim⁺肌细胞）可调控雌虫卵黄腺发育和产卵，提示配对诱导的雌虫成熟是一个涉及多种因素和多阶段的复杂机制。干细胞群体分析显示异质性，包括多能性和谱系定型前体细胞。跨物种比较揭示了生殖干细胞中的物种特异性转录程序，可能解释日本血吸虫的高繁殖力等生物学差异。结论：研究人员的综合性研究建立了理解血吸虫干细胞生物学和分化的全面框架，为生殖发育和成熟提供了基础见解，并指出了抗血吸虫病的新靶点。研究结论部分翻译：综上所述，研究人员的综合性研究建立了理解血吸虫生物学的基础分子和细胞框架，破译了致病性相关细胞分化背后的调控程序，并突出了抗血吸虫病的潜在靶点。