Label-Free Myelin Fingerprinting：基于相干反斯托克斯拉曼光谱的人死后成人脑切片平台

《Advanced Science》：Label-Free Myelin Fingerprinting: An Adult Human Post-Mortem Brain Slice Platform via Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy

　　

动物模型与简单细胞培养通常缺乏与人类生理足够的重叠，难以有效研究人类神经系统疾病；一种新兴的替代方案是使用人类器官型切片培养（Organotypic Slice Cultures，OSCs）。本研究通过活力研究表明，使用化学限定无血清培养基培养的人死后胼胝体（Corpus Callosum，CC）组织OSCs，在体外至少维持8天（Days In Vitro，DIV）的活力。纳入CC简化了以髓鞘为重点的研究，其潜力通过使用无标记相干反斯托克斯拉曼光谱（Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy，CARS）成像可视化髓鞘内分子信息得以凸显。本研究界定了死亡时间（Time Of Death，TOD）后32小时的窗口期，在此期间髓鞘免受基线测量的影响。最后，作为概念验证，与人非多发性硬化（Multiple Sclerosis，MS）髓鞘相比，表征为髓鞘退行性变的人类特异性疾病MS的CC组织显示出改变的髓鞘光谱特征迹象。总之，本研究提供了结合以CARS为重点的分析方法开发人类髓鞘模型的表征，将其确立为未来研究髓鞘基神经系统疾病的新型工具集。

研究背景方面，当前动物模型与简单细胞培养在模拟人类神经系统疾病复杂环境上存在局限，绝大多数动物研究无法成功转化为人类临床应用，监管机构已推动以人类数据驱动的新方法学（New Approach Methodologies，NAMs）替代临床前药物评估中的动物数据。急性与器官型切片培养（OSCs）作为NAMs的例子，能维持复杂的人类特异性细胞间相互作用、非保守生物过程及大部分大脑原有架构，但现有OSCs多基于啮齿类优化，人脑组织OSCs常依赖手术切除或胎儿来源组织，死后组织作为替代来源可覆盖更广泛病理与非病理条件及手术不可及脑区，却缺乏成熟培养与髓鞘研究方案。因此，研究人员旨在建立含富含高度有序白质纤维的胼胝体（CC）的OSC方法，简化髓鞘研究可能，开发新型化学限定脑脊液样培养介质以提升生物学相关性并减少变异，确定组织保持活力且髓鞘大体不受影响的培养窗口，并结合相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）与k-means聚类检测细微髓鞘改变，以多发性硬化（MS）组织为概念验证，为髓鞘基疾病研究提供新工具。该研究发表于《Advanced Science》，得出结论：研究表征了人髓鞘模型开发并结合CARS聚焦分析方法，确立其为未来髓鞘基神经系统疾病研究的新型工具集。

关键技术方法包括：使用荷兰脑库（Netherlands Brain Bank，NBB）与阿姆斯特丹正常衰老脑收集（Normal Aging Brain Collection Amsterdam，NABCA）提供的死后人脑CC组织（含9例MS与7例非MS对照，死后延迟小于8小时）；采用振动切片机与定制切片矩阵制备不同厚度切片，于气-液界面培养；使用增强化学限定切片培养介质（enhanced chemically defined-slice culture media，eSCM）与人工脑脊液（artificial Cerebrospinal Fluid，aCSF）；通过乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑内盐（MTS）、Calcein AM/7-AAD assay评估活力；采用CARS成像结合k-means聚类分析髓鞘光谱；通过免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）检测MHC-II、IBA1、GFAP、GS等胶质标志物。

研究结果部分，各小节结论如下：

3.1 OSCs are Viable up to 8 Days In Vitro：通过LDH、MTS、DAPI计数与Calcein AM/7-AAD荧光活细胞成像评估，OSCs在人CC中维持稳定活力达7–8 DIV；LDH释放初始16小时因切片损伤略有上升后稳定，MTS显示eSCM较aCSF代谢活性更高，核密度平均稳定，活细胞比例在各DIV保持稳定，证实定制eSCM可支持长期培养。

3.2 Pre-Existing Disease Baseline Dictates Microglial MHC-II Trauma Responses While Astrocytes Maintain Homeostatic Stability：IHC显示DIV0 MHC-II+细胞呈变形虫样吞噬形态，DIV1异质化，DIV8混合灌木与过渡形态；MHC-II密度DIV1短暂上升后DIV8下降（2毫米切片显著），非神经对照（NM7）全程低表达；IBA1+小胶质细胞在非神经对照与进行性核上性麻痹（Progressive Supranuclear Palsy，PSP）病例稳定，路易体病（Lewy-Body Disease，LBD）病例DIV1急性下降后DIV8恢复；星形胶质细胞总数与静息/反应性比例在各DIV稳定，GFAP分支数与长度无显著增加，表明小胶质细胞为主要机械应力感应者，星形胶质细胞维持稳态未引发慢性神经胶质增生。

3.3 Standard Bulk Assessment Reveals Little Change Over DIV While CARS Lipid Analysis Spots Subtle Myelin Changes：FluoroMyelin成像显示DIV1与DIV7髓鞘结构可比但后期背景增加；CARS成像揭示DIV8髓鞘碎片化与脂质滴积累，～2850 cm^?1CH₂对称伸缩峰强度DIV8较DIV0降低（非MS组织簇均值从0.58降至0.31），k-means聚类显示DIV8光谱剖面扁平化；DIV1与DIV0无显著差异，表明改变发生于培养后期；MS组织DIV0即显示CH₂峰强度低于非MS（均值0.41 vs 0.58）且肿胀区信号重分布，证实CARS可检测培养诱导与疾病相关髓鞘成分改变。

讨论部分总结：研究证明CARS显微镜可对富髓鞘CC组织高分辨率无标记可视化，建立的新型培养介质使组织活力至少维持8 DIV，死后32小时内髓鞘结构近基线；CARS与k-means分析为活体人脑切片培养中髓鞘异常提供稳健方法，系首次将CARS用于动态活人脑切片培养。介质为无血清化学限定以减变异并避血清诱发星形胶质增生；薄片（0.45、1.4毫米）活力优于2毫米但厚片利于冻存与3D架构；早期培养（32小时内）髓鞘保存佳，DIV8出现脂质丢失与脂质滴积累限制高倍成像；小胶质细胞介导急性激活后消退，星形胶质细胞表型稳定；CARS较FluoroMyelin更敏感觉察培养中细微生化改变，MS髓鞘CH₂减少与既往固定组织观察一致，肿胀区生化改变可能与轴突-髓鞘通讯障碍相关；未来动态CARS可阐明髓鞘异常时序，支持人源背景药物筛选。

结论部分翻译：研究人员表征了人髓鞘模型开发过程中结合以CARS为重点的分析方法的发展，将其确立为未来研究髓鞘基神经系统疾病的新型工具集。