《Advanced Science》：TET1 Inhibition Promotes Therapeutic Sensitivity in TP53-Mutant GBM by Influencing Genome Fragility and Altering TAMs Biology
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TP53突变（TP53mut）与胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）患者的治疗抵抗相关，但其潜在机制尚不完全清楚。在此，研究人员在GBM模型中确定了P53功能降低与表观遗传调控因子TET1（Tet methylcytosine dioxygena
TP53突变（TP53mut）与胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）患者的治疗抵抗相关，但其潜在机制尚不完全清楚。在此，研究人员在GBM模型中确定了P53功能降低与表观遗传调控因子TET1（Tet methylcytosine dioxygenase 1）表达增加之间的关联。在TP53mut GBM细胞中，TET1敲低影响了基因组脆弱性，包括DNA损伤、衰老和端粒缩短。具体而言，研究结果与以下模型一致：TET1结合ROS1启动子，并可能通过使启动子保持低甲基化状态以及下游ERK磷酸化来维持ROS1表达。相反，抑制TET1与ROS1表达减少、ERK信号减弱以及基因组脆弱性增加相关。此外，肿瘤细胞中的TET1耗竭与体外和体内肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）生物学的改变相关，包括浸润增加、分化、M1样极化和吞噬能力增强。值得注意的是，在体外和体内，将TET1抑制剂Bobcat339与顺铂联合使用可协同抑制TP53mut GBM生长，改善生存且无明显毒性。研究结果表明，TET1可能是TP53mut GBM中治疗抵抗的潜在介导因子和有前景的治疗靶点。
研究背景方面，胶质母细胞瘤（GBM）是成人最常见且最具侵袭性的原发性颅内恶性肿瘤，患者中位生存期不足2年。超过50%的GBM病例存在TP53突变（TP53mut），这与总生存期较差密切相关。突变型P53不仅因缺乏野生型蛋白的肿瘤抑制功能及无法激活经典靶基因而表现为功能丧失（LOF），还通过激活非经典靶基因获得功能获得（GOF），两者均促进肿瘤进展。除促进GBM生长外，TP53mut还对多种治疗方式产生抵抗，包括针对肿瘤细胞的细胞毒性药物以及靶向肿瘤微环境（TME）的疗法如抗血管生成剂、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）调节剂和免疫检查点抑制剂。尽管针对TP53mut GBM开展了大量临床试验，但因快速适应和获得性耐药，大多成效有限。因此，探究TP53mut导致GBM治疗抵抗的机制对改善疗效和生存至关重要，阐明机制可能揭示新靶点并提高治疗敏感性。基因组脆弱性限制被认为是TP53mut介导抵抗的关键促进因素，其特征包括持续性DNA损伤、细胞衰老、结构性染色体改变如端粒和着丝粒异常以及活性氧积累。诱导基因组脆弱性可协同增强化疗、放疗和免疫治疗等多种抗癌疗法疗效，而TP53mut被证实可减轻基因组脆弱性，但在TP53mut GBM中调控基因组脆弱性的关键分子未知，且缺乏针对该过程的有效干预策略。表观遗传失调参与基因组脆弱性并介导TP53mut治疗抵抗，TET1作为主导表观遗传调控因子通过催化5-甲基胞嘧啶（5mC）氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）驱动DNA去甲基化和基因调控，其下调或功能障碍与深刻表观遗传改变相关，TET1表达受miRNA、调控蛋白或启动子甲基化抑制，野生型P53可结合TET1启动子抑制其转录，TET1失调影响肿瘤基因组脆弱性如DNA损伤反应（DDR）、关键信号通路和端粒完整性，在GBM中TET1上调损害DNA修复降低电离辐射反应，但TET1介导的表观重编程和基因组脆弱性在TP53mut肿瘤治疗抵抗中的作用及机制尚不清楚。为此研究人员探索将常规化疗药与靶向TET1相关通路抑制剂联合作为克服耐药的潜在策略。
主要关键技术方法包括从TCGA数据库获取GBM的RNA测序数据集及对应突变信息，筛选TP53mut与TP53wt且IDH野生型（IDHwt）样本的差异表达基因（DEGs）并进行基因集富集分析（GSEA）；收集北京天坛医院2014年6月至2019年9月的TP53wt（n=17）和TP53mut（n=14）IDHwt GBM手术标本制作组织芯片行免疫组化（IHC）染色；使用多种TP53mut和TP53wt GBM细胞系及U937细胞进行培养、慢病毒感染、siRNA和cDNA转染；通过Western blotting、免疫荧光（IF）、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）检测、端粒定量荧光原位杂交（Q-FISH）和qPCR、活性氧检测、Transwell浸润实验、流式细胞术、克隆形成实验、CCK-8细胞活力检测、凋亡检测评估细胞和分子表型；开展ChIP-seq和ChIP-qPCR、ATAC-seq数据分析、焦磷酸测序分析表观遗传调控；进行皮下和原位异种移植小鼠模型实验评估体内疗效；使用SynergyFinder计算药物协同评分；所有统计分析采用GraphPad Prism 9.0进行。
研究结果部分，首先是2.1 Elevated TET1 Expression in GBM Harboring TP53mut，研究人员通过对TCGA队列IDHwt GBM样本的TP53mut与TP53wt进行差异基因表达谱分析和Limma分析，发现DNA修饰相关DEGs中仅TET1显著，IHC显示TP53mut GBM组织TET1表达显著高于TP53wt，细胞实验中TP53mut细胞系TET1表达高于TP53wt，TP53wt细胞中siRNA干扰TP53后TET1表达升高，TP53mut细胞过表达TP53-cDNA后TET1降低，免疫荧光显示TP53耗竭核内TET1增加、TP53过表达核内TET1减少，表明TP53功能降低与TET1上调相关。
其次是2.2 Knocking Down TET1 Expression Promotes Genome Fragility in TP53mut GBM，研究人员用TET1-shRNA或siRNA敲低TP53mut GBM细胞，免疫荧光显示γ-H2AX焦点显著增加，SA-β-Gal阳性细胞增多，Q-FISH和qPCR显示端粒缩短，活性氧水平升高，用DNA去甲基化剂地西他滨（Dec）处理可逆转DNA损伤和衰老表型但不变活性氧，表明TET1敲低促进TP53mut GBM基因组脆弱性。
接着是2.3 Knockdown of Wild-Type P53 Function Sensitizes Cells to Genome Fragility Modulated by TET1 Knockdown，研究人员在TP53wt细胞中同时敲低TP53和TET1，发现单独TET1敲低不改变γ-H2AX，单独TP53敲低增加DNA损伤，双敲低γ-H2AX显著增加；SA-β-Gal活性双敲低显著高于单敲低和对照；端粒长度双敲低在两种细胞系均显著缩短，表明TP53功能降低与TET1抑制共存时对基因组脆弱性有协同促进作用。
然后是2.4 TET1 Knockdown Is Associated with Altered TAMs Biology in TP53mut GBM，研究人员用TP53mut GBM细胞条件培养基与U937细胞共培养，流式显示shTET1组CD68?细胞比例增加，M1型（CD68?CD86?）比例显著增加，M1/M2比值升高，Transwell显示巨噬细胞迁移增加；皮下异种移植模型中shTET1组肿瘤内CD86?（M1）强度显著增加，CD206?（M2）无显著差异；共培养吞噬实验显示shTET1组CD68?GFP?双阳性TAMs增多，表明TET1敲低改变TAMs分化、极化、迁移、浸润和吞噬能力。
接下来是2.5 TET1 Binds to the ROS1 Promoter and Is Associated with CpG Island Methylation Regulation in TP53mut GBM，研究人员对TP53mut GBM细胞行TET1过表达ChIP-seq，发现TP53mut细胞中TET1结合峰更多，整合RNA-seq鉴定出78个基因，其中ROS1为Top候选，ChIP-seq和ChIP-qPCR证实TET1富集于ROS1启动子CpG岛，焦磷酸测序显示TET1敲低后ROS1启动子CpG岛甲基化百分比增加，表明TET1结合ROS1启动子CpG岛并与其低甲基化及转录相关。
再者是2.6 TET1 Influences ROS1 That May Contribute to ERK Phosphorylation, DNA Damage, and Cellular Senescence in TP53mut GBM Cells，研究人员发现TET1敲低降低ROS1 mRNA和蛋白，Dec可恢复ROS1；TET1敲低降低ERK磷酸化（pERK/ERK），过表达ROS1可逆转；过表达ROS1降低γ-H2AX和SA-β-Gal活性，表明TET1通过ROS1影响ERK磷酸化并关联基因组脆弱性。
随后是2.7 TET1 Knockdown Sensitizes TP53mut GBM to Cisplatin Treatment，研究人员用NCCN指南推荐的四种药物治疗，CCK-8显示TET1敲低仅增强顺铂剂量依赖性生长抑制，不影响替莫唑胺等；15 μM顺铂下TET1敲低增加凋亡（Annexin V/Mito-CMXRos比升高、核皱缩）；TP53wt细胞过表达TET1则减弱顺铂抑制和凋亡；DepMap分析显示顺铂耐药细胞系TET1表达显著高于敏感型，表明TET1敲低增敏TP53mut GBM对顺铂的反应。
接着是2.8 Combined TET1 Inhibitor and Cisplatin Treatment Results in Synergistic Antitumor Effects in Vitro，研究人员用TET1抑制剂Bobcat339与顺铂处理TP53mut细胞，SynergyFinder显示ZIP评分超10为强协同（U251为11.06，LN18为15.74）；12.5 μM Bobcat339与6.25 μM顺铂联合较单药显著抑制集落形成、增加凋亡、增加γ-H2AX阳性细胞、升高活性氧，SA-β-Gal因细胞死亡难评估，表明Bobcat339与顺铂体外协同抗肿瘤。
最后是2.9 Synergistic Antitumor Effects of the TET1 Inhibitor and Cisplatin In Vivo，研究人员用U251-luc原位异种移植NCG小鼠模型，分组给予Vehicle、Bobcat339、顺铂、联合治疗，活体成像显示联合组肿瘤生长显著抑制，单药Bobcat339无显著影响，顺铂单药中等抑制；联合组体重减轻较顺铂单药显著缓解；Kaplan–Meier分析联合组无进展生存显著延长，表明体内Bobcat339与顺铂协同抑瘤、减轻体重丢失并延长生存。
讨论部分总结，研究人员指出TP53mut在GBM中高频出现且治疗反应差，通过分析TCGA DEGs发现TET1在TP53mut中过表达并经IHC验证，既往研究提示野生型P53可结合TET1启动子抑制转录，本研究在GBM中支持P53功能降低与TET1上调相关但需直接机制证据。基因组脆弱性限制如癌细胞防弹衣促耐药，突变P53促此表型，TET1调控DDR和耐药，本研究表明TP53功能降低与TET1敲低协同促基因组脆弱性，TET1上调可能是抵消损伤的生存机制，抑制TET1解除此许可使损伤转为致死性衰老。活性氧增加不能被Dec逆转，TET1可能非依赖去甲基化调控线粒体稳态产生活性氧。ChIP-seq整合分析鉴定ROS1为TET1靶标，TET1结合ROS1启动子CpG岛维持低甲基化和转录，抑制TET1致高甲基化和ROS1沉默，ROS1过表达和Dec可减弱DNA损伤等但需催化活性实验确认甲基化依赖机制。TET1敲低抑制ERK磷酸化可被ROS1挽救，ROS1介导ERK自磷酸化，ERK激活减轻DNA损伤促耐药，本研究支持TET1/ROS1–ERK/DNA损伤/衰老轴相关性而非因果，需排除其他通路。TET1抑制仅增敏顺铂，与报道一致，顺铂凋亡依赖野生型P53但在TP53mut中TET1敲低仍增敏，因TET1敲低相关基因组脆弱性使顺铂易感，Bobcat339与顺铂体内外增效且耐受良好减轻恶病质。TET1敲低促TAMs浸润、M1极化、吞噬，TET1家族调控TAMs表型和免疫调节配体，肿瘤衍生细胞因子可能为桥梁，本研究提示肿瘤内在TET1是重编程TAMs的靶点。局限性在于未剖析突变P53的GOF与LOF，免疫缺陷模型无法评估T细胞等，需免疫 competent模型进一步研究。总之，TET1可能介导TP53mut GBM治疗抵抗，TP53直接转录调控TET1在GBM需研究；TET1抑制关联基因组脆弱性和ROS1/ERK信号，与顺铂协同增效且安全；TET1调制TAMs生物学提供靶向TME新策略，靶向TET1联合抗肿瘤疗法是有前景的策略。
研究结论部分翻译为，总之，本研究支持一个潜在模型，即TET1可能促成TP53mut GBM中的治疗抵抗。TP53对TET1的直接转录调控在GBM中需进一步研究。此外，我们提出TET1抑制与基因组脆弱性及ROS1/ERK信号相关。TET1抑制支持一种潜在的治疗脆弱性，并可能与顺铂协同，这与提高抗肿瘤疗效和良好安全性相关。另外，我们揭示了TET1在调制TAMs生物学中此前未表征的作用，并为结合TET1抑制靶向TME提供了新见解。总体而言，这些发现表明在抗肿瘤疗法中靶向TET1可能代表一种有前景的治疗策略。
